Science丨工程化细菌检测肿瘤cfDNA
今天介绍的文献是8月11日发表在Science上的Engineered bacteria detect tumor DNA，本文作者Jeff Hasty是加州大学圣地亚哥分校的分子生物学和生物工程系的教授，生物电路研究所的主任。
基因水平转移是指生物将遗传物质传递给其他细胞而非其子代的过程，与垂直转移相对。自然感受态是指细菌能够从环境中吸收DNA的一种生理状态，也是细菌中的一种普遍现象。从环境中的裂解细胞摄取的裸露DNA到达细胞质后（该方式也称为转化），外源DNA与RecA蛋白结合，RecA协助外源DNA在受体基因组中寻找同源性区段进行同源重组。自然感受态是细菌中的一种普遍现象。巴氏不动杆菌（Acinetobacter baylyi）是一种非致病性的土壤细菌，处于自然感受态。研究人员利用这一原理设计了一种工程化的巴氏不动杆菌作为结肠癌原位的cell-free DNA采样器，该设计被命名为“靶向CRISPR识别水平基因转移的细胞检测（Cellular Assay for Targeted CRISPR-discriminated Horizontal gene transfer, CATCH）”。
首先为了检验细菌可以检测特定哺乳动物DNA的设想，研究人员选择了KRAS作为目标检测位点，KRAS 是人类癌症中的重要癌基因。研究人员设计并生成了 KRAS 同源臂内带有卡那霉素抗性基因 (kanR) 的转基因供体人类癌细胞。为了构建传感器细菌，将具有KRAS同源臂的互补区域插入巴氏不动杆菌。从肿瘤DNA中进行基因水平转移的传感器细菌将获得卡那霉素抗性，并通过抗生素选择板上的连续稀释进行定量从而实现检测。研究人员分别测试了“大插入”设计，其中必须转移 2 kb 的供体盒以获得卡那霉素抗性；以及“小插入”设计，其中只必须转移8个碱基对 (bp)以修复两个终止密码子。
作者在液体培养基和固体琼脂培养基上测试了这些设计。“大插入”生物传感器液体培养基和固体琼脂上都实现了对自纯化质粒的供体 DNA的检测，在琼脂板上，他们还实现了对原始的、未纯化的裂解物的检测，尽管其浓度仅略高于检测限。而“小插入”设计将检测效率提高了约10倍，甚至可以可靠地检测原始裂解物。在各种条件下，固体琼脂培养下的检测都比液体培养物的检测更灵敏和有效。这些实验证实设计的生物传感器可以检测出未纯化的 DNA。
KRAS 密码子 12 的突变发生在 27% 的 结肠癌（CRC）中 ，占所有 CRC KRAS 突变的 72%，并且通常在实体瘤中常见。为了测试传感器细菌是否能够区分野生型和突变型 KRAS (KRASG12D)，作者利用了巴氏不动杆菌的内源型 I-F CRISPR-Cas 系统，使用巴氏不动杆菌原间隔邻基序(PAM)设计了三个针对 KRASG12D 突变位置处的野生型 KRAS 序列的 CRISPR spacer。传感器细菌通过 CRISPR 介导的 DNA 降解来排斥野生型 KRAS，但允许整合 KRASG12D 序列。设计的三个spacer中的两个同时阻断野生型和突变型 DNA 的转化。而spacer2（其中 KRASG12D 突变消除了 PAM 位点）选择性地仅允许 KRASG12D 供体 DNA。传感器细菌被证明可以以单碱基特异性检测 KRAS 基因中的突变热点。
接下来，研究人员在类器官培养中评估了传感器和供体结构。使用了该课题组之前用CRISPR-Cas9基因组工程生成的：BrafV600E； Tgfbr2Δ/Δ； Rnf43Δ/Δ； Znrf3Δ/Δ； p16Ink4aΔ/Δ (BTRZI) 小鼠类器官，其在注射到小鼠结肠中时可重现锯齿状 CRC。锯齿状CRC约占CRC病例的25%，是治疗抵抗力最强且结果最差的亚型之一。研究人员使用供体 DNA 构建体转导BTRZI类器官，生成供体 CRC 类器官，并用更高效的“小插入”设计的生物传感器与其裂解物共孵育培养实现检测。研究人员还估计了生物传感器对粪便中目标 DNA 的检测限。将供体质粒添加到生物传感器和粪便的确定混合物中进行测试，对于给定的孵育体积和时间下，检测限为 3 pg 质粒或 2.7 × 105 个目标 DNA 拷贝。
在体外实验后，作者接着在体内测试了CATCH系统。首先确认了BTRZI可以将肿瘤 DNA 释放到结直肠腔中。并通过小鼠结肠镜检查，将工程化的CRC类器官原位注射到小鼠结肠中，形成结肠肿瘤。接下来进行了原位CRC实验，免疫缺陷的NSG小鼠被注射供体或非供体类器官。5周后，肿瘤长入管腔，将工程化的细菌通过直肠灌肠两次。 随后对小鼠实施安乐死，并收集结肠直肠和管腔流出物进行分析。将梯度稀释液涂在含有不同抗生素组合的琼脂上。从肿瘤到生物传感器的水平基因转移仅在被移植了传感器细菌的荷瘤供体小鼠中检测到。并通过抗生素抗性、绿色荧光、16S 测序和单个菌落的水平基因转移介导的kanR修复等方式来确认抗性菌落是工程生物传感器菌株。因此，CATCH 在实验模型中实现了区分结直肠癌小鼠与健康小鼠。
最后，作者设计了活体生物传感器来检测和分析非工程化癌症DNA。在此设计中，与KRAS靶DNA重组后，阻遏物tetR将从基因组中删除。如果进入的 KRAS序列在G12基因座处是野生型，Cascade（I-F型CRISPR-Cas效应复合物）会识别并降解它。如果G12 基因座发生突变，PAM位点和CRISPR-Cas的靶向就会被消除，输出基因的表达就会开启。作者使用LS174T和RKO两种细胞系基因组的PCR产物作为供体 DNA，在体外测试了这种针对天然DNA的传感器设计。具有KRAS spacer的生物传感器可以准确地检测到来自LS174T细胞（KRASG12D）的DNA序列，证明了生物传感器可以实现对天然目标DNA的辨别。
综上所述，研究人员设计了一种可以检测体内肠道中CRC脱落的特定哺乳动物DNA的活体生物传感器，且无需格外的样品制备或处理。该设计的同源臂和CRISPR spacer是模块化的，使得该策略可以很容易地用于检测和分析任意感兴趣的目标序列。此外该设计在体内对肠道进行直接取样，具有重要的优势。胃肠道含有丰富的脱氧核糖核酸酶(DNase)，这限制了游离DNA的半衰期，从而降低下游粪便样本的信息含量。放置在原位的细菌生物传感器可以实现在DNA释放后被局部DNA酶降解之前捕获并保存DNA。通讯作者Hasty表示，虽然这种新的方法距离临床应用还需要进一步开发和完善，但是他的团队仍在继续优化这种先进的生物传感器策略。
