Nat Commun丨Cas9介导的Ndrg2敲除增强树突状细胞的伤口愈合再生潜力
大家好，今天给大家分享的文献是本月发表在Nature Communications上的一片文章，题为《Cas9-mediated knock out of Ndrg2 enhances the regenerative potential of dendritic cells for wound healing》。本文通讯作者是斯坦福大学基因组工程与合成生物学实验室的Lei S. Qi教授。该实验室致力于基因组工程、以发现为中心的合成生物学和表观遗传基因治疗，研究治疗癌症、神经退行性疾病和复杂遗传疾病的新疗法，并开发了第一个核酸酶死亡的DCas9、用于靶向基因激活和抑制的CRISPR干扰和CRISPR激活、用于核酸实时成像的LiveFISH等技术。
研究背景
树突状细胞（dendritic cell，DC）作为人体内典型的抗原提呈细胞，正常情况下大多处于非成熟状态，在各种抗炎细胞因子及抗生素的作用下能够触发分子微环境，导致CD80，CD86和MHC-II的低表达，转化为耐受性树突状细胞（tolerance dendritic cells，tolDC），有助于建立和维持免疫耐受性。
临床上患有糖尿病和周围血管疾病的患者往往由于免疫功能异常与功能性微血管再生能力受损而产生难以修复的慢性伤口。作者利用tolDC的单细胞RNA测序（scRNA-seq），确定与其作用相关的N-myc下游调控基因2（Ndrg2），设计了CRISPR/Cas9方法敲除以增强DC的再生能力，通过将编辑后的细胞种植在水凝胶并覆盖于糖尿病和非糖尿病患者的慢性伤口上，成为一种有效的治疗方法。
研究内容
- 确定DC中基因编辑的潜在靶点
1）tolDC中Ndrg2表达降低
为了确定DC中基因编辑的潜在靶点，作者通过scRNA-seq比较了经过诱导耐受的tolDC与未经诱导的DC的转录组之间的差异。作者用野生型小鼠（C57/BL6）按标准程序培养小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC），并使用维生素D3诱导产生tolDC。通过特征性标记Itgax和H2-Ab1来筛选DC，得到八个细胞群。
作者发现，VD3诱导后细胞Ndrg2表达下调、Vegfa（编码血管内皮生长因子A）过表达，表明其促血管生成特性可能与Ndrg2抑制有关。因此，作者确定Ndrg2是一个值得进一步研究的目标基因。
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2）DC祖细胞高表达Ndrg2且在诱导后显著减低
在未处理的DC中，Ndrg2表达最强的是细胞群6，共表达造血干细胞标志物Cd34、Csf1r（编码CD115）、Flt3（编码CD135）和Clec9a（编码DNGR-1），与标准树突状细胞祖细胞表达谱一致。
与未处理的细胞相比，VD3处理几乎完全消除了Ndrg2及其共表达基因的表达，同时诱导了Kit（原癌基因）和Vegfa的表达。
3）抑制DC中的Ndrg2表达可促进血管形成
为了研究抑制Ndrg2是否促进了DC促血管生成，作者将BMDC诱导耐受之后与人脐静脉内皮细胞共同培养，进行血管形成试验。选用的诱导剂为VD3和脂多糖（LPS）或地塞米松。
处理24h后，作者发现，与未处理的DC相比，Ndrg2抑制的DC在体外刺激了血管的形成，显示出更高的血管分支数，更长的分支长度和更高的总网状面积。
VD3/LPS处理组的血管生成反应最强。
考虑到Ndrg2在DC祖细胞中的强表达以及抑制Ndrg2所产生的促血管生成反应，作者假设Ndrg2的敲除会改变BMDC的转录发育，从而产生能够改善伤口愈合过程的细胞。
- BMDC中Ndrg2 敲除的CRISPR/Cas9方法设计
为了开发一种用于小鼠BMDC中Ndrg2的CRISPR/Cas9 敲除方法，作者使用由Cas9蛋白和小向导RNA（sgRNA）组装的核糖核蛋白（Cas9-RNP）复合物导入细胞。
1）确定最高效的敲除方案
为了达到最高的编辑效率，作者使用针对Ndrg2基因组位点的三种向导RNA，改变反应的细胞数量和RNP浓度，比较了DCs的转染率，优化得到最佳方案。
使用Sanger测序和CRISPR编辑工具（ICE）计算敲除率为91%。
体外免疫细胞化学染色同样观察到NDRG2蛋白表达显著降低。
2）方法不会产生可观察到的脱靶效应
为了分析方法在靶位点引入的特异性突变以及潜在的脱靶效应，作者对CRISPR编辑的树突状细胞进行了超高深度的全基因组测序。
用Cas-OFFinder算法找潜在的脱靶位点。在敲除位点的上下游200 bp范围内确定了14个位点。通过人工与三个sgRNA序列比对，作者只在其中两个位点上发现了一个原位邻近基序（PAM序列），所有其他预测的脱靶位点都没有显示出与sgRNA序列的相似性。
结果证实了方法产生的脱靶效应可以忽略不计。
3）方法有效阻止DC成熟并诱导再生基因表达谱
保证方法效率与特异性后，作者通过对CRISPR编辑的DC进行了scRNA-seq，并将其与未处理DC和VD3处理的DC转录组进行了比较，以评估Ndrg2敲除对DC实际转录的影响。
大多数Ndrg2敲除细胞具有未成熟的DC特征，高表达Csf1r, Ccr2和Cx3cr1。
而对照组和VD3处理的细胞大多比较成熟且高表达Ccr7, Flt3, Cd80和Cd83。
使用CytoTRACE，作者根据mRNA分布比较了单个细胞的相对分化状态，发现主要包含Ndrg2敲除细胞的细胞群分化程度最低，而另两种细胞群则表现出更高级的分化状态。表明Ndrg2在DC祖细胞中高度表达，并促进DC向成熟表型分化。
这些经过编辑的的未成熟DC比VD3处理的DC表现出更强的Vegfa表达以及促进伤口愈合的相关基因上调，如Fn1（编码纤维连接蛋白-1）和Mmp12（编码基质金属蛋白酶-12）以及抗氧化基因Prdx4和Mgst1。
作者使用了GeneTrail3在单细胞水平上研究不同条件下细胞信号通路的差异调节，发现Ndrg2敲除细胞中与血管生成、上皮细胞迁移和细胞外基质降解相关通路显著上调，表明对伤口愈合有有益影响。
- 水凝胶递送Ndrg2敲除的DC方法设计与疗效验证
确定了该方法能特异性诱导树突状细胞中的再生基因表达谱后，作者设计了将编辑后细胞植入水凝胶并覆盖于伤口的方法，并测试了实际疗效。
首先用荧光染料AM染色，证实了水凝胶内DC的高细胞活性和均匀分布。
1）方法促进非糖尿病伤口愈合
作者首先对三组野生型小鼠的全层切除伤口进行试验，通过细胞播种后立即将水凝胶放置在伤口床上验证不同细胞对伤口愈合的影响。实验组中采用CRISPR/Cas9敲除Ndrg2后的DC。阴性对照组，作者使用3个非靶向的向导RNA进行同样的敲除过程。空白对照组则采用没有任何细胞的水凝胶。
Ndrg2敲除的DC处理的伤口愈合速度明显更快，并且在第11天完全重新上皮化。
组织学上，实验组显示出完全再生的上皮和更厚的真皮。免疫荧光染色显示，伤口组织血管化明显增强，证实编辑后的DC促进血管生成和加速伤口愈合。
2）方法促进糖尿病伤口愈合
作者进一步研究方法是否有利于糖尿病伴愈合潜力受损的患者伤口。因此，作者用同样方法应用于瘦素受体基因（Lepr）发生纯合突变的糖尿病小鼠模型。
与之前的结果相似，编辑过的DC也促进了血管生成，显著改善了伤口组织的血管化。
3）Ndrg2敲除的DC通过生长因子信号靶向伤口成纤维细胞
接下来，为了探究移植的DC如何与伤口愈合环境中的不同细胞类型相互作用并影响其个体转录特征，作者在第10天各组创面愈合曲线出现差异时从三组小鼠伤口处移植组织进行scRNA-seq。
在所有细胞类型中，成纤维细胞在各组间的差异表达基因数量最多，这表明敲除后的DC治疗对伤口床内成纤维细胞的影响最大。
其中几个上调基因已被证明在伤口愈合中起关键作用，如Ngfr（编码神经生长因子受体）、Lgals1（编码半乳糖凝集素-1）。
同时，负责催化胶原交联的Plod2和催化细胞外基质蛋白折叠的Ppib上调，表明这种愈合的机制可能在于增加细胞外基质蛋白合成和胶原交联。
作者使用CellChat分析配体-受体相互作用，发现Ndrg2敲除的DC在伤口环境中表现出更强的外向信号活动，并且在细胞通信网络中表现出更强的总相互作用强度。
Ndrg2敲除的DC还通过胰岛素样生长因子（IGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）等途径与伤口成纤维细胞交流，并显示Vegf、Spp1（骨桥蛋白）信号上调，是糖尿病伤口早期修复的关键驱动因素。
总结
在该研究中，作者使用CRISPR/Cas9细胞基因编辑技术，在不需要病毒载体的情况下，对未成熟DC中的Ndrg2进行敲除，实现了90%的敲除率和极高的特异性。该方法阻止DC成熟，增强其再生和促血管生成功能，这是VD3药物治疗无法实现的。
作者进一步将体外工程细胞与治疗性水凝胶结合起来，用于体内细胞递送，通过小鼠实验证明其可以改善不同模型中慢性伤口的愈合，为治疗提供了一种高效、稳健且易于使用的方法。
文献信息
Henn, D., Zhao, D., Sivaraj, D. et al. Cas9-mediated knockout of Ndrg2 enhances the regenerative potential of dendritic cells for wound healing. Nat Commun 14, 4729（2023）. https://doi.org/10.1038/s41467-023-40519-z
