ACS NANO丨香蒲新甙-四面体框架核酸系统：急性肾损伤治疗中的线粒体恢复和抗氧化作用
大家好，今天为大家分享的文献是2023年5月发表于ACS NANO上的Typhaneoside-Tetrahedral Framework Nucleic Acids System: Mitochondrial Recovery and Antioxidation for Acute Kidney Injury treatment。
背景图
作者介绍
本文的通讯作者为四川大学的林云锋教授。林云锋教授的主要研究方向包括：框架核酸纳米材料在基因和药物传递方面研究以及口腔再生医学关键理论与技术研究。
研究背景
急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）是由多种原因（如脓毒血症、心脏手术、肾毒性药物使用等）引起的一系列综合征，其中肾小球滤过率骤然下降，并造成体内代谢产物的潴留，扰乱水、电解质、酸碱平衡，危害各脏器功能。AKI在住院病患，尤其是ICU病人中的发病率与死亡率都较高，且AKI患者在后期发展为终末期肾脏病，亦或是加重已有肾脏病情的风险都较高。然而目前AKI的治疗仍采取支持性策略，以纠正原发病因为主，临床上缺乏特效药物。因此对于AKI药物的研发迫在眉睫。
想要研发药物，就要从AKI的病理生理机制着手，其中肾脏的线粒体功能引发了较多关注。在体内，肾脏拥有仅次于大脑组织的最丰富的线粒体，尤其是近端小管细胞。线粒体的内膜含有电子传递链，能够驱动ATP的生成。在生理条件下，电子传递链能产生适量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）参与信号通道。然而，在缺血再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤下，冗余ROS的生成超过了线粒体的氧化能力，ROS因此累积，并增加了线粒体外膜的通透性，导致促凋亡因子细胞色素c（Cytochrome C, Cyto C）从线粒体释放到细胞质并激活Caspase导致细胞凋亡。此外，分裂和融合失衡导致的线粒体断裂也是ROS的潜在来源。最终，近端肾小管上皮细胞凋亡、代谢紊乱以及ATP耗竭共同导致肾小管衰竭，引起肾小球滤过率下降和肾功能损害。
另一方面，蒲黄——一味传统中药，其有效提取物香蒲新甙（Typhaneoside, Typ）具有生物活性与抗氧化作用，然而就和大多数中药单体一样，Typ因其降解快、水溶性差、生物可及性低而具有有限的治疗作用，需要进一步优化。四面体框架核酸（tetrahedral framework nucleic acids , tFNAs）由四条单链DNA经一锅法制成，制备简单，可用作药物装载与递送系统，应用多样。此外，tFNAs因其框架表面带负电，因此可通过小窝蛋白介导的胞吞进入细胞，使胞内药物累积，且tFNAs肾毒性较低，并具有清除ROS的抗氧化能力。
因此，本文便将tFNAs与Typ结合，从而优化后者的生物可及性与稳定性，从而减轻线粒体氧化应激，使得肾小管细胞的线粒体功能得到恢复，减轻细胞凋亡，改善AKI预后。
研究结果
图1 香蒲新甙-四面体框架核酸系统（TTC）的合成与表征
首先，作者合成并表征了他们所设计的香蒲新甙（Typ）-四面体框架核酸系统（tFNA-Typ complex, TTC）。他们先通过4条ssDNA合成tFNA，再混合Typ，合成最终的TTC结构，并通过PAGE进行结构鉴定（图1 A&B）。先前的研究已经证实小分子可以通过凹槽对接机制与tFNAs结合，且Typ嵌入到DNA双螺旋的方式也已被证明类似于核酸检测分子GelRed。因此他们用GelRed染色了tFNAs和TTC，并测量了荧光光谱，结果显示TTC的荧光强度低于单独的tFNAs（图1C）。同时，他们利用动态光散射检测纳米颗粒的粒径和ζ电位（图1 D&E）。此外，TTC的紫外-可见光吸收光谱也被证明同时包含tFNAs的特征吸收峰（~ 260 nm）和Typ的特征吸收峰（~ 378 nm）（图1 F）。作者还采用原子力显微镜和透射电镜对纳米颗粒进行了表征，显示TTC的大小近20 nm，与前文相符（图1 G&H）。tFNAs可能是中药单体和类似生物活性分子的潜在载体系统。作者通过将人肾小管上皮细胞HK-2与带有Cy5标记的中药单体、tFNAs及TTC共同孵育，并用流式与共聚焦显微镜检测，结果显示较多的tFNAs和TTC在4 h与6 h能进入细胞内部，证实了Typ的结合并不干扰tFNAs的内化（图1 I&J）。
图2 TTC减轻I/R损伤后的细胞凋亡
缺血再灌注，即I/R损伤所致的肾小管细胞凋亡过程如图2A所示。作者对于HK-2肾小管上皮细胞采用缺氧6 h-再复氧24 h的模型模拟体内的I/R损伤过程，并采用CCK-8检测缺氧复氧建模后细胞的活度变化，结果显示，I/R模拟组细胞增殖能力显著降低，而加入了tFNAs（250 nM）、Typ（50 μM）或TTC（250 nM/50 μM）后，TTC组的细胞增殖能力明显高于tFNAs和Typ组（图2 B）。此外，作者采用流式细胞术评估了不同组别的细胞凋亡情况，结果表明：TTC可以同时减轻I/R处理后的细胞早期与晚期凋亡水平（图2 C&D）。作者还通过检测Cyto C和Caspase-3的蛋白表达验证了潜在的凋亡通路，共聚焦与western blot的结果表明TTC加入后显著抑制这两个蛋白的表达，这也提示了I/R中线粒体损伤可能导致Cyto C逃逸，并通过激活Caspase-3促进细胞凋亡，与图2A所示原理相符（图2 E&F）。
图3 I/ R损伤后TTC恢复细胞的线粒体功能
接着，作者推测TTC在细胞调控中的潜在机制与其对线粒体的作用有关。他们采用MitoTracker对细胞线粒体进行染色，而后加入Cy5标记的TTC后发现，TTC与线粒体共定位程度较高，提示TTC对于线粒体的靶向能力（图3 A&B）。已有研究表明，过量的 ROS可以从线粒体内膜中释放促凋亡因子Cyto C，而上一部分的结果证明了Cyto C是细胞凋亡的潜在启动因子。所以，作者通过MitoSOX检测了加入不同纳米颗粒的细胞内线粒体ROS的水平，结果表明I/R损伤导致细胞mtROS水平广泛增加，而与tFNAs和Typ相比，TTC更为显著地降低了mtROS的水平，提示TTC可能可以阻碍线粒体ROS的生成（图3 C&D）。线粒体稳态是ROS的潜在来源，为了维持线粒体的形态并满足细胞的能量需求，线粒体不断分裂与融合，然而在I/R等氧化应激的条件下，细胞融合减少而分裂增加，最终导致线粒体的碎片化，因此检测线粒体碎片化程度可以反应氧化应激条件下的细胞线粒体动力学水平。作者使用MitoTracker对线粒体染色，结果显示TTC处理后线粒体碎片化减少（紫色椭圆圈出部分），提示TTC在恢复线粒体动力学方面的作用（图3 E&F）。不仅如此，线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential, MMP）与线粒体动力学密切相关，作者采用JC-1探针评估细胞内MMP水平，随着MMP增高，JC-1单体可在线粒体基质中累积，从而产生红色荧光，而低MMP的情况下JC-1单体无法累积，产生绿色荧光。结果显示，TTC增强了红绿荧光强度比，提示TTC可以稳定线粒体膜电位，减少线粒体极化（图3 G&H）。以上结果共同表明，TTC可以精确靶向线粒体，维持线粒体形态，恢复线粒体动力学水平，减少线粒体ROS，这可能便是TTC的潜在作用机制。TTC的作用示意图如图 3I所示。
图4 I/R损伤后TTC通过KEAP1/SOD2信号以及纤维化进程减轻线粒体氧化应激
已有研究表明，KEAP1是氧化应激的传感器，当其被耗尽时ROS急剧下降；而另一方面，SOD2是一个重要的抗氧化酶。因此作者通过共聚焦与western blot评估加入不同纳米颗粒后细胞中KEAP1/SOD2的蛋白水平变化。I/R损伤后KEAP1的表达增加，而TTC处理后KEAP1显著降低，并伴有SOD2表达的上调，提示SOD2起到抗氧化的作用（图4 A&B&E&F）。此外，先前的研究报道了线粒体功能障碍、ATP减少与CKD的发生和进展密切相关，AKI后不完全的恢复可导致肾脏纤维化，使得细胞外基质蛋白在肾脏中病理性地累积。因此，作者检测了AKI向CKD进展的几个指标，结果显示，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I型胶原蛋白（Col I）的水平在I/R损伤后均显著升高，而在 TTC处理组中α -SMA和Col I的表达水平明显低于其它组，这表明TTC具有一定的抗纤维化潜能（图4 C&D&E&F）。
图5 小鼠诱导AKI后TTC可恢复其肾功能并靶向肾小管损伤
对细胞展开充分实验后，作者进一步探究I/R损伤的AKI动物模型并研究TTC在体内的治疗效果，具体实验路线为：选取6~8周雄性C57小鼠，分离双肾并夹闭双侧肾蒂30 min诱导缺血，而后松开夹闭以实现再灌注，并通过尾静脉注射给予小鼠生理盐水、tFNAs、Typ亦或是TTC，最终于24h后收集小鼠肾脏（图5 A）。首先，作者探究TTC在体内的肾脏靶向能力，通过静脉注射Cy5标记的TTC并利用体内成像系统检测其生物分布，发现AKI手术组的荧光分布主要位于肝脏与肾脏，且与健康对照组相比，荧光时间持续且亮度增强，提示TTC被健康肾脏快速消除，但在AKI小鼠肾脏中滞留（图5 B）。为了观察TTC在体内细胞水平上的生物分布，他们采用近端小管特异性标记物LTL标记了肾脏切片中的肾小管，结果显示TTC上的Cy5信号与代表肾小管的LTL信号高度重叠，提示TTC在体内也具有精准靶向肾小管的能力（图5 C）。而后，作者对造模并注射纳米药物24h后收集到的小鼠血清与肾脏标本进行分析。 PAS染色与HE染色结果表明AKI小鼠肾脏结构异常，肾小管刷状缘缺失，透明管型形成，细胞脱落，在tFNAs和Typ单体治疗组中，仍有十分明显的局灶性损伤，而在TTC组中小管损伤明显得到改善（图5 D&E）。随机选择以上组织学视野并进行小管损伤评分定量，结果显示I/R损伤后肾小管损伤评分升高，而在用tFNAs、Typ和TTC治疗后，其得分均有显著下降，且TTC组最为明显（图5 G）。对小鼠血液进行肾功能指标检测，结果显示AKI后小鼠血清肌酐、尿素氮皆升高，而TTC组显著降低，提示TTC能在体内恢复小鼠肾功能（图5 F）。
图6 TTC在体内减少AKI后肾损伤与细胞凋亡
接下来，作者通过评估小鼠肾脏中KIM-1水平进一步探究其损伤程度，这是因为KIM-1仅在受损肾小管中特异性表达，结果显示，假手术组与TTC处理组的KIM-1荧光强度较低，与前文肾小管损伤评分结果一致（图6 A&D&E）。不仅如此，作者还采用TUNEL法检测肾组织切片中的凋亡细胞，结果表明，与假手术组相比，AKI组凋亡细胞大量累积，而与其它治疗组相比，TTC组的凋亡细胞百分比相对最低，提示TTC在体内也具有抗凋亡作用（图6 B&C）。
图7 TTC保护AKI小鼠线粒体免受损伤
接着，作者采用透射电镜观察5组小鼠肾切片中线粒体的形态。结果显示，AKI手术组的近端小管细胞中产生了广泛的线粒体损伤，表现为线粒体的肿胀、基质的变亮、线粒体嵴的紊乱与碎片化、线粒体膜的破坏、基质物质的释放等等，而在TTC处理组中，小鼠肾脏中受损线粒体的数量显著减少，且线粒体延长的比例更高，线粒体嵴结构更为完好（图7）。
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图8 TTC在体内调控KEAP1/SOD2信号
与体外细胞实验结果一致，免疫组化分析和western blot结果显示，TTC处理后的肾脏中SOD2显著表达，且KEAP1表达水平有所降低，进一步证实了TTC可以在体内通过抗氧化作用减少细胞凋亡（图8 A~F）。
研究总结
本文的研究者们设计并合成了一种能够结合中药单体活性分子的四面体框架核酸系统，证明了香蒲新甙能嵌入在tFNAs的螺旋结构中，并提高其生物利用度。体内外实验结果显示，纳米材料TTC能精确靶向肾小管细胞中的线粒体，对肾脏没有显著毒性，同时具有良好的线粒体修复与抗细胞凋亡能力，从而抑制肾损伤，恢复肾功能。总的来说，TTC在治疗AKI以及其它线粒体相关疾病中具有非常好的应用潜力。
局限性方面，本文只在细胞层面探索了TTC对于AKI-to-CKD纤维化进程的改善潜力，而缺乏在体内亦或是更长程的纤维化程度观察。此外，文中探究的KEAP1/SOD2信号仍较为局限，未来也需要探索其它可能的线粒体信号通路和氧化中和酶，从而完善TTC的潜在机制。
原文链接
Yan, R.; Cui, W.; Ma, W.; Li, J.; Liu, Z.; Lin, Y. Typhaneoside-Tetrahedral Framework Nucleic Acids System: Mitochondrial Recovery and Antioxidation for Acute Kidney Injury Treatment. ACS Nano 2023, 17 (9), 8767–8781. https://doi.org/10.1021/acsnano.3c02102.
