JACS丨植物细胞激发的具有多糖层结构的膜化的凝集体原细胞
大家好，今天分享的文献是发表在JACS上的一篇文章，标题为“ Plant Cell-Inspired Membranization of Coacervate Protocells with a Structured Polysaccharide Layer”。
本文的通讯作者是中国科学院化学研究所的乔燕研究员。乔等人开发了一种方法，即通过在无膜液体状微滴上覆盖一层刚性的多糖保护层，制备膜化凝集体作为原细胞模型。膜化不仅赋予胶体稳定性、防止聚集和聚结，而且能够促进生物分子在膜上的选择性螯合和化学交换。围绕凝集体原细胞的多糖壁可充当刺激响应性结构屏障，使酶触发的膜裂解能够触发大肠杆菌的内化并将其杀伤。膜化凝集体能够空间组织成结构化的组织状原细胞组合，为模拟代谢和细胞间通信提供了一种手段。研究认为，此工作中开发的原细胞表面工程为构建先进的合成细胞模拟物和复杂的类细胞样行为提供了一个平台。
研究背景：
与具有细胞膜的细胞相比，凝集体缺乏封闭的隔膜。为此，人们已经提出了两亲性分子、（表面活性剂囊泡、脂质体、共聚物、蛋白质、聚乙二醇化大分子或纳米颗粒、和带电组件等）对凝集体微滴进行膜化，以实现半渗透性调节和表面功能化。植物细胞中的细胞壁由半渗透的刚性碳水化合物层组成，这些碳水化合物层能够提供机械支持、调节蛋白质扩散和介导细胞通讯。受植物细胞壁的启发，在该项研究中，作者假设携带刚性主链的高分子量多糖可以通过弱吸引力（如氢键和电荷-偶极相互作用）在凝集体液滴表面吸附，从而形成细胞壁状的保护层。刚性聚合物链的空间位阻效应可有望抑制块体聚合物渗透到冷凝液相中。
文章要点：
为了验证上述假设，作者用鱼精蛋白（Prot）和叶酸（FA）制备了凝聚体原细胞，在Prot和FA之间的多价静电吸引、氢键和FA的芳香堆积的驱动下经历了复杂的凝聚，形成了含有微米大小液滴的混浊分散体。鱼精蛋白是一种高电荷多肽，在治疗中被用于浓缩和递送DNA。叶酸也是一种生物相容性化合物，可被用作靶向配体，用于将附着的显像剂和治疗剂输送到癌症组织和炎症部位。随后，通过添加异硫氰酸四甲基罗丹明标记的葡聚糖（TRITC-葡聚糖，500kDa）即可实现Prot/FA凝集体的膜化（图1a-e）。此外，无膜的凝集体微滴易于聚结和持续生长，而膜化了的凝集体微滴粒径几乎不变（图1f-l）。并且通过在不同时间点添加葡聚糖可以调节原细胞的尺寸大小，即分别在1 min、2 min、3 min时间点处添加葡聚糖，可分别得到1.8 μm，2.2 μm，2.8 μm的凝集体原细胞（图1m）。
图1：TRITC标记的葡聚糖膜化凝集体微滴
紧接着，作者还验证了不同分子量葡聚糖（500 K、155 K、65-85 K）与不同Prot/FA（3/1、5/1、10/1）配比所形成的凝集体微滴的相互作用，以及温度对凝集体膜化的影响。葡聚糖对凝聚体上的膜化通过膜和内部的荧光强度之比来确定(PS/I) （图2a-i）。以500 K的葡聚糖为例，当Prot/FA的比率从3/1增加到5/1，10/1时，PS/I值从1.8增加到4.1，9.8，结果表明Prot/FA比率越大，葡聚糖渗透进凝集体内部的越少（图2a-c）。同样地，这个趋势在155 K和65-85 K葡聚糖膜化的凝集体中也是存在的（图2d-i）。当温度从25℃升高到70℃时，凝集体内部的葡聚糖会向膜上转移（图2j-k），PS/I值从1.8升高到3.6，这是因为较高温度会导致氢键的影响变弱而不是Prot的二级结构发生变化。上述现象有很好的普适性，用PDDA和ATP、Plys和ATP代替Prot和FA合成的凝集体微滴也具有这些特性（图2l-m）。
图2：葡聚糖和凝集体之间的相互作用
多糖包被凝集体原细胞的螯合特性以及分子和颗粒在膜上的扩散运动都得到了改善。细胞信号传导是生物生命的一个重要方面，细胞可以感知细胞外环境并作出反应。膜化凝聚体为构建先进的合成细胞模拟物和复杂的类细胞样行为提供了一个平台。为此，作者评估了多糖膜包被凝聚体的固有性质 (图3a)。荧光素和BSA可进入dextran包被的凝集体中，而大尺寸的ZIF-8（60 nm）和E.coli（2 um）则被排挤在外，对于无膜包被的凝集体，荧光素、BSA、ZIF-8、E. coli均可进入凝集体内（图3b-i）。同时，作者还利用FRAP实验验证了膜化凝集体内部和膜上的流动性（图3j-l），结果表明膜化凝集体内部具有类似液体的流动性质，而膜上没有此性质。
图3：葡聚糖膜化的凝集体原细胞的界面选择性。
然后，作者利用流式证实了内部含有不同分子（TRITC-BSA，红色和FITC-BSA，绿色）的膜化凝集体原细胞具有相似的尺寸和复杂性（图4a-b）。而封装了FITC-BSA的凝集体原细胞比RITC-BSA凝集体原细胞荧光高1个数量级，这是因为它们具有不同的荧光特征（图4c）。接着，作者利用小分子的快速扩散来考察不同种群间膜化凝集体的化学通讯。种群1中封装了葡萄糖氧化酶，种群2中封装了Amplex red、HRP。当向体系中加入葡萄糖后12min，种群1内部红色荧光增加，表明加入葡萄糖后，小分子（H2O2和间苯二酚）在两个不同凝集体之间扩散。而且在单个包含葡萄糖氧化酶、HRP和Amplex red的原始细胞中，会更快的发生此级联反应，因为缩短了底物和产物的扩散时间（图4d-g）。
图4：膜化的凝集体种群间的化学通讯。
由于多糖可被特定的酶降解，作者还检测了这类原细胞的酶活性膜裂解行为，并且证明了该酶活性膜裂解可进一步控制原细胞和活细胞（如大肠杆菌）之间的相互作用（图5）。研究表明葡聚糖膜化的凝集体在2min内可被葡聚糖氧化酶完全裂解而不损伤凝集体的结构，从而扰乱界面完整性，调节凝集体原细胞的封闭性能（图5a-b）。膜裂解后，会黏附邻近的细胞，促进物质的交换，基于此发展了一种响应策略用于收集和杀死细菌。当膜化凝集体与大肠杆菌共孵育时，两者均可保持完整；而向体系中加入葡聚糖氧化酶后，10min后无膜凝集体会聚集大肠杆菌并将其杀死在凝集体内部；而且阳离子化的凝集体会导致细胞在20min后死亡（图5c-d）。同时，作者还利用流式量化了凝集体与大肠杆菌之间的相互作用（图5e-h）。当无膜凝集体与大肠杆菌共培养时，30min后大肠杆菌数目明显减少，即被无膜凝集体聚集在其内部并杀死。
图5：膜裂解以及原细胞-细胞相互作用。
此外，研究还表明，膜化凝集体作为稳定的构建块，可成功地将原细胞组织构建成类组织实体（图6）。在离心浓缩膜化凝聚体后，共聚焦显微镜下可观察到紧密排列的组织状凝聚体上层结构（图6a-e）。图6f是原组织的 CLSM成像，原组织包含三个不同群体的TRITC -葡聚糖膜化凝集体微滴，这些微滴装载了β-gal, GOx和HRP (10% FITC-HRP掺杂)。乳糖的加入引发了级联酶反应，红色荧光在原组织室的内部逐渐增加，表明建立了凝集体原细胞间的信号通讯。此外，原组织在转移到96孔板后仍能保持稳定，且无明显崩解坍塌（图6g）。
图6：原细胞组织形成类组织的超级结构。
总结：
在这项研究中，研究人员开发了一种方法，通过在无膜液体状微滴上覆盖一层刚性多糖保护层，制备膜化凝集体作为原细胞模型；而且膜化凝集体能够空间组织成结构化的组织状原细胞组合，为模拟代谢和细胞间通信提供了一种手段；膜化凝集体作为稳定的构建块，可成功地将原细胞构建成类组织实体；原细胞表面工程为构建先进的合成细胞模拟物和复杂的类细胞样行为提供了一个平台。
