Gastroenterology丨基于粪便miRNA特征的结直肠癌诊断
大家好，今天分享的文献是5月份发表在Gastroenterology上的一篇文章，标题为“ A fecal miRNA signature by small RNA sequencing accurately distinguishes colorectal cancers: results from a multicentric study”。
通讯作者是Alessio Naccarati和Barbara Pardini，意大利都灵FPO IRCCS Candiolo 癌症研究所的成员。研究方向为利用下一代测序、生物信息学等工具，开发基于miRNA、EV、微生物组等生物标志物用于癌症诊断。
研究背景：
结直肠癌(CRC)每年约有180万新诊断病例，虽然早期CRC可以有效治疗，但CRC仍然是癌症相关死亡的第二大原因。大多数欧洲国家都实施了基于粪便隐血检测的CRC筛查计划，主要检测方式是粪便免疫化学测试(FIT)。FIT对识别晚期结直肠腺瘤(AA)的敏感度有限。结肠镜虽然用于筛查癌症和癌前病变，但其检测为侵入性且成本较高。根据FIT结果接受结肠镜检查的患者中，只有大约5%的人最终会出现明显的病变(CRC或AA)。由于粪便检测的特异性相对较低，导致大量假阳性和大量不必要的结肠镜检查。将传统粪便检测与其他非侵入性检测的粪便分子生物标记物结合起来，可以降低需要结肠镜检查的人群数量、降低检测成本，并减少患者的不适感。
近年来，机器学习(ML)算法已被证明能够准确区分不同患者的重要特征；可解释的ML方法识别新的分子生物标记物特征以改进早期CRC诊断。粪便样本中小非编码RNA因其在大规模临床研究中的应用而引起了人们的兴趣。肿瘤分泌的小非编码RNA直接和连续地释放到肠腔中，它们的表达水平可能会随着结直肠癌和癌前病变的存在而改变。miRNA非常稳定，可在粪便中准确检测它们，粪便中特定的miRNA 改变与肠道微生物组组成相关，并用作非侵入性 CRC 生物标志物。
基于粪便样本的研究发现了与CRC相关的少量miRNA，但这些研究通常是在小群体中开展，没有考虑人口统计学特征、不同的生活方式和饮食习惯。此外，粪便 miRNA 谱与患者临床病理特征相关的证据有限。
设计思路：
图1：本项研究设计
本项多中心研究旨在通过深度测序探索粪便样本中的 miRNA 图谱，这些图谱能够表征 CRC 患者与对照个体的特征，并区分结直肠腺瘤或其他胃肠道疾病。这些分析是在不同的独立队列中进行的，采用相同的方案进行参与者招募、样本收集和小 RNA 测序实验/分析。
结果与讨论：
1. 基于 2 个欧洲人群的结直肠癌患者粪便 miRNA 谱
图2：粪便差异microRNA筛选
通过小RNA-seq，每个粪便中平均检测到479个miRNA(范围：86-1516)。在IT队列和CZ队列中，分别鉴定了250和29个差异miRNAs (图2A)。在两个队列中，25个粪便DEmiRNAs有一致的表达趋势(图2B) 。通过结合结直肠癌患者的临床资料，发现3个miRNAs(miR-607-5p、miR-677-5p和miR-922-5p)表达水平随着肿瘤大小的增加而显著降低(图2C和D)。在疾病晚期或淋巴结侵犯的患者中，miR-922-5p也显著降低(图2D)。相反，在20个上调的miRNAs中，有19个miRNAs表达水平随着肿瘤大小的增加而增加，其中miR-1246、miR-1290、miR-148-3p和miR-1945p与肿瘤大小显著相关。在有淋巴结侵犯的患者中，11个miRNAs显著升高 (图2D)。
2. 粪便来源的miRNA 可区分结直肠癌患者与对照个体
为了实现基于miRNA 特征的，机器学习用于 CRC 检测。首先，作者利用 25 个 DEmiRNA，将 70% 的 IT 队列和 CZ 队列作为训练集。结果表明区分 CRC 患者与对照个体的最佳 miRNA 特征为： miR-607-5p、miR-6777-5p、miR-4488、miR-149-3p 和 miR-1246（图 2E）。该模型在测试集、验证集均有良好表现（图 2F）。 随后，收集102 名 CRC 患者肿瘤组织和匹配的邻近粘膜，进行配对差异表达分析。在 25 种粪便 DEmiRNA 中，有 14 种miRNA存在差异表达（图 3A），其中 7 种在肿瘤组织中上调miRNA（miR-21-5p、miR-1246、miR1290、miR-148a-3p、miR-4488、miR-149-3p、miR-12114）与粪便趋势一致。然而，在肿瘤和邻近组织中， 5 名CRC 患者粪便中显著下调的miRNA（miR-607-5p、miR-6777-5p，包含于miRNA 诊断模型中；miR-6076、miR-922-5p、miR-9899）表达较低（补充表4A）。与周边粘膜相比，miR-21-5p、miR-1290、miR-148a-3p 和 miR-200b-3p 在腺瘤组织中显著上调，而miR-4508显著下调（图3A）。
图3：粪便差异microRNA在不同样本中的表达
将 CRC DEmiRNA 与 IT 和 CZ 队列中患有胃肠道疾病和其他癌前病变的患者的 DEmiRNA进一步比较发现：25 种 CRC DEmiRNA 中有 21 种miRNA的水平在至少另一种胃肠道疾病中显著改变（图 3B）。其中，在患有溃疡性结肠炎、憩室炎、nAA 或 AA 的患者中，60% 的 CRC DEmiRNA 也表达异常（图 3B）。在克罗恩病 (2 个 miRNA) 或憩室病 (5 个 miRNA) 患者中观察到失调的 miRNA 数量最少，而在增生性息肉患者中未发现 DEmiRNA。
3. 小 RNA 测序可在粪便免疫化学测试剩余样本中检测到 miRNA
对FIT 队列的 185 个可用剩余样本进行小 RNA 测序，平均检测到 618 个 miRNA。有4种miRNA（miR-607-5p，miR-1246，let- 7a-3p、miR-922）在所有样本中可被检测到，超过一半的样本中检测到 18 种miRNA（图 3C）。miRNA诊断模型中包含的三种 miRNA（miR607-5p、miR-1246、miR-6777-5p）在超过 95% 的样本中检测到（图 3C），而miR-149-3p可在112 个样本中被检测到（57.4%），miR-4488可在57个样本中被检测到（30.8%）（图3D）。
结论：
研究人员收集了一系列标本，并进行了1273次小RNA测序。首先，研究人员对来自意大利和捷克队列的粪便样本（155例结直肠癌，87例腺瘤，96例其他肠道疾病，141例结肠镜阴性对照）的miRNA谱进行了研究，通过机器学习策略确定了关键miRNA特征，并在来自141名CRC和80名对照健康人的粪便样本中进行了验证。miR-149-3p、miR-607-5p、miR-1246、miR-4488和miR-6777-5p在内的五种miRNA特征将患者与对照组区分开来（AUC=0.86, 95% CI=0.79-0.94），并在独立队列中得到验证（AUC=0.96, 95% CI=0.92-1.00）。
通过比较132例肿瘤/腺瘤伴邻近粘膜、210例血浆细胞外囊泡样本和185例FIT剩余样本的miRNA谱，发现miR-1246和miR-4488在血浆细胞外囊泡中和粪便中出现了一致性显著失调；FIT剩余样品中的miRNA谱与保存缓冲液中收集的粪便的miRNA谱具有良好的相关性。这项多中心研究全面评估了粪便miRNA谱的表达特征作为非侵入性CRC诊断的生物标志物。
