bioRxiv丨开发用于单细胞分辨率多维空间组学的多组学原位成对测序 (MiP-Seq)
大家好，今天分享的文章题为《Development of Multiomics in situ Pairwise Sequencing (MiP-Seq) for Single-cell Resolution Multidimensional Spatial Omics》。这项研究于2023年1月在预印本在线期刊bioRxiv上发表。该研究通讯作者曹罡教授长期致力于新兴单细胞组学技术的开发，并将其应用于神经免疫感染系统生物学的研究。
这篇文章介绍了一种名为MiP-Seq的高通量多组学原位成对测序策略，该策略能够以亚细胞分辨率有效解析DNA、RNA、蛋白质和小分子等多种生物分子。研究人员利用MiP-Seq技术对下丘脑进行了动态空间基因谱的描述，检测了肿瘤基因突变和亲本基因的等位基因特异性表达，并结合成像技术得到了与神经元活动和细胞生化特征相关的空间多组学图谱。此外，研究团队还提出了一种名为“信号稀释策略”的方法，以解决挤压信号对原位测序适用性的挑战，从而改进了空间多组学和精确诊断的能力，促进了与基因表达谱相关的细胞功能分析。这项研究为深入理解生物系统的复杂性提供了新的工具和方法。
研究背景
多细胞生物中，特定细胞内适当基因的共同转录可以被巧妙地协调。这些空间转录谱可以控制不同细胞的功能，以完成复杂的生理任务。全面的空间组学描述为了解特定细胞的分子功能铺平道路，并通过例如在癌症治疗前表征免疫微环境等方式极大地推进精确诊断。最近，最先进的空间转录组学方法已被开发用于高度多重RNA原位检测：这些方法包括SeqFISH、MERFISH、ISS、FISSEQ、STARmap、INSTA-Seq、Ex-Seq、Slide-Seq、HDST和DBiT-Seq。然而，空间组学技术仍处于起步阶段。例如，大多数方法只能破译一种生物分子的空间信息，高通量空间组学需要多轮测序。因此，迫切需要提高捕获效率、吞吐量、细胞分辨率和光学拥挤以及降低这些实验成本的方法。在这项研究中，我们开发了一种名为高通量多组学原位成对测序（MiP-Seq）的方法，能够以亚细胞分辨率有效检测脑组织中的多重DNA、RNA、蛋白质和生物分子。
结果
MiP-Seq是一种用于DNA和RNA的原位检测的方法。它通过使用特定的挂锁探针来实现。对于DNA和RNA的检测，MiP-Seq使用直接挂锁探针，而对于蛋白质和其他生物分子的检测，则采用抗体缀合核酸的挂锁探针。
在应用MiP-Seq进行空间RNA分析时，首先要进行锁式探针的杂交，即将锁式探针与目标RNA相结合。然后进行原位滚环扩增（RCA）的步骤，这是一种将锁式探针与起始引物连接并扩增的方法。每个挂锁探头都包含两个条形码（B1和B2），这样可以增加信号解码的能力，提高数据解读的准确性。
为了提高RCA模板的连接效率，研究人员比较了不同的连接酶，并选择了SplintR连接RCA模板的方法。这种连接方法依赖于精确匹配的碱基配对，从而可以通过MiP-Seq检测目标RNA中的单核苷酸多态性（SNP）。由于挂锁探针和起始引物（IP）的连接是靶标依赖性的，并且与靶标RNA和挂锁探针互补，RCA可以牢固地在原位进行。
为了实现高通量检测，对原位滚动扩增产物（RCP）进行多轮测序，并通过连接和信号解码来解读数据。这样可以获取更多的信息并提高数据的准确性和可靠性。
为了提高信号解码吞吐量，作者采用了一种策略，在每一轮中同时对双条形码碱基进行测序。该策略利用四个荧光信号中的两个的不同组合，在每个循环内对十种不同的组合进行条形码解码。通过进行 N 轮测序，可以解码出10个N基因。相比其他原位测序方法通常只能解码4个N基因，这种方法减少了测序轮次并提高了基因检测通量。
由于使用了RCA，通过对双条形码进行测序，我们能够清楚地识别和解释以点表示的RCP信号。这使得我们能够区分m6A甲基化RNA和非甲基化RNA，例如在转染HEK293T细胞中进行MiP-Seq分析。
（图1B-1D和图1D-1E中可见该过程的示意图）
（图1G中显示MiP-Seq可以区分m6A甲基化RNA和非甲基化RNA）
图1 学原位成对测序 (MiP-Seq) 在空间生物分子谱中的应用。
使用MiP-Seq技术进行大规模多基因检测的实验
通过MiP-Seq测序技术，研究人员成功地在小鼠大脑切片中检测到了10个基因的空间转录组图谱。令人惊喜的是，这些基因的表达模式与艾伦脑科学研究所的结果一致。为了构建3D基因表达架构，研究人员对来自整个小脑的多个间隔为200μm的切片进行了多重基因检测，并通过重建图像展示了Calb1、Gad1、Neurod1和Plp1基因在整个小脑中的表达和分布情况。
此外，研究人员还对MiP-Seq技术进行了优化，以在整个斑马鱼端脑中检测foxg1a、hoxb3和gad1b基因的原位基因表达模式。这项技术的优化将为深入研究斑马鱼端脑的发育和功能提供重要的工具。
图2 10个基因的大视野、3D 重建和整体空间分析。
利用MiP-Seq高通量测序技术，研究人员成功地绘制了下丘脑对角带水平肢(HDB)核内100个基因的空间转录组图谱。为了获得这些数据，研究人员进行了图像配准、候选点识别、解码、细胞分割和基因分配等一系列高通量图像处理步骤。通过对这些数据进行分析，研究人员揭示了HDB中100个基因的空间分析结果，其中包括了单细胞分辨率的神经递质相关基因、神经元标记基因和神经元活动标记基因。
基于这些基因图谱，研究人员还发现了肽激素基因、神经递质相关基因以及它们的相应受体基因的独特空间表达模式。此外，通过空间基因共表达分析，研究人员还发现了某些基因在空间上的共表达关系。
这些研究结果为我们深入了解HDB核内基因表达的空间特征以及其在神经递质调控和神经元活动中的作用提供了重要线索。
图3 通过MiP-Seq 对对角带水平肢 (HDB) 核中 100 个基因进行空间转录组分析。
MiP-Seq是一项多功能策略，可用于解析大脑切片中DNA的空间组织。在MiP-Seq中，DNA首先经过变性处理，然后与挂锁探针和初始引物一起与DNA靶标进行杂交，并使用T4 DNA连接酶进行连接。通过MiP-Seq，我们可以清晰地揭示基因在三维基因组架构中的空间定位，例如Rbfox3和Nr4a1基因。此外，MiP-Seq还可以用于检测DNA点突变。研究人员利用MiP-Seq检测C6神经胶质瘤中的DNA点突变，并明确显示了WT（野生型）和突变型神经胶质瘤细胞中的Nptxr基因。除了DNA，MiP-Seq还可以应用于探索其他生物分子的时空分布，如神经递质和激素。通过将抗体与核酸结合进行原位测序，MiP-Seq实现了高通量和高灵敏度的检测，以实现对生物分子亚细胞水平的研究。例如，MiP-Seq被应用于探索抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）在脑切片中的时空分布。MiP-Seq清晰地揭示了GABA的空间分布，并且这一结果可以通过传统的免疫染色方法进行验证。总之，这些数据表明，MiP-Seq是一种可靠的策略，可用于检测不同生物分子，包括DNA、RNA、蛋白质、神经递质和激素的时空分布。
图4 通过 MiP-Seq 检测 DNA、RNA、蛋白质和神经递质。
多成像空间基因图谱
单个细胞的多样性和特定功能高度依赖于它们的基因谱。在中枢神经系统中，邻近的神经元可以表现出不同的功能活动和一系列基因表达。研究者开发了一种体内原位方法，将同一单个神经元的功能活动和基因表达谱联系起来。首先，在Thy1-GCAMP6s小鼠的初级视觉皮层中进行体内双光子Ca2+成像，以识别来自350×350×80 μm³体积中所有神经元的尖峰相关体细胞钙信号。随后，对具有不同神经元标记基因和神经递质基因（如Gad1、Vip和NPY）的相应成像区域的切片进行MiP-Seq。MiP-Seq图像中的核信号用于对齐体内双光子Ca2+图像堆栈并与高光谱受激拉曼散射成像相结合，以协调生化分子图谱与原位基因图谱。在小鼠大脑的穹窿下器官中，MiP-Seq检测到了10个细胞标记基因的原位表达，并将其与最接近的拉曼光谱图像对齐。这种方法将有助于我们更好地理解神经元的功能和基因调控。
图5 集成多个成像分析的原位多组学和 MiP-Seq 检测的空间基因图谱。
连续稀释 MiP-Seq 策略
在多轮原位高通量解码过程中，光信号拥挤，特别是对于高表达水平的基因，是信号询问中最具挑战性的步骤。为了克服这个问题，研究者们开发了一种连续稀释MiP-Seq策略，其中将基因分配给具有不同独特稀释引物序列的不同条形码组。通过使用不同的测序引物，信号在各轮成像中被稀释。同时，选择了某些基因作为参考基因，每轮都通过锚定引物对这些基因进行测序。经过多轮测序和成像后，所有基因信号基于参考基因信号比对叠加，重建高密度空间转录组图谱。通过使用参考基因Gfap和Gad2进行比对，对Cxcl2、Agtr1b、Slc17a6、Ccl2、Il1b、Col1a1、Tnf和Calcr进行两轮连续稀释MiP-Seq。实验证明，这种连续稀释MiP-Seq方法成功实现了精确的原位基因信号稀释和表达模式重建。因此，这种方法可以极大地促进高通量转录组作图过程中高密度信号的精确询问。
图6 用于解决光学拥挤信号的顺序稀释策略。
结论
总体而言，MiP-Seq是一种仅需要N轮测序即可对10个N基因进行空间分析的有效方法，具有高通量、单核苷酸和多组学检测能力。它可以与功能成像相结合，获得具有多维信息的组织图谱。在这个新兴的研究领域，许多技术需要大幅改进，例如超分辨率和低毒性成像系统、长读长测序策略以及功能成像与原位代谢组质谱的集成。这些技术的快速发展将导致许多组织和器官的详细全面的分子和功能图谱的多维重建，这可能会将我们带入生物医学研究的新领域。
