JACS | 端粒靶向嵌合体可靶向降解端粒重复结合因子蛋白
大家好，今天分享的文献是2023年5月发表在JACS上题为 “Telomere Targeting Chimera Enables Targeted Destruction of Telomeric Repeat-Binding Factor Proteins”。通讯作者是哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心的魏文毅教授和美国纽约西奈山伊坎医学院的金坚教授。魏文毅教授长期从事肿瘤生物学的基础研究和肿瘤防治研究工作，在蛋白质泛素化和降解领域处于世界领先水平。金坚教授主要从事新型组蛋白甲基转移酶的选择性抑制剂和G蛋白偶联受体的偏置配体的研究。
研究背景
由于端粒缩短和细胞周期性分裂，正常细胞会复制性衰老，而癌细胞可以通过激活端粒酶来获得无限的复制能力，从而延长端粒末端（图1A）。
因此，靶向端粒酶是延缓癌症恶化的一种简单有效的方法。目前已经开发出多种靶向端粒酶的方法治疗癌症，例如通过使用小分子抑制端粒酶活性和寡核苷酸抑制剂破坏端粒酶复合物在端粒上的精确定位，但效率低且受到耐药性的限制。 Imetelstat 是第一个针对端粒酶设计的核苷酸药物，还需要进一步的研究来充分评估其有效性和安全性。
为了克服不可成药端粒酶的问题，作者团队开发了基于核苷酸的蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 平台，该平台可以降解不可成药的 RNA 结合蛋白、转录因子和 G-四链体结合蛋白。PROTAC技术为提高核苷酸药物效率问题提供新的途径。
图 1. TRF1/2在端粒维持中的作用
设计思路
作者将DNA PROTAC的应用扩展到非转录因子蛋白和TRF1/2。TRF1/2蛋白是Shelterin亚复合体的主要成分，与端粒内的TTAGGG重复序列特异性结合，特别是在Lys421（TRF2的Lys488）与G4，Asp422与C5ʹ等之间形成几个关键的氢键（图 1B）。鉴于TRF1/2在端粒-端粒酶相互作用中起着桥接作用，作者开发了TeloTAC策略，即使用TRF1/2作为降解目标来诱导端粒的Shelterin复合物并随后破坏端粒酶与端粒末端的结合。为了实现TRF1/2的靶向降解，通过叠氮化物-炔烃环加成（SPAAC）反应将TRF1/2结合基序（TTAGGG）与VHL配体结合，设计了几种不同类型和长度接头的TeloTAC分子。TeloTAC进入细胞后，寡核苷酸部分直接与TRF1/2蛋白结合，而VHL配体部分募集VHL E3连接酶以促进TRF1/2的泛素化和随后的降解（图2）。
图 2. TeloTAC通过招募E3连接酶诱导TRF1/2泛素化和随后的降解
结果与讨论
- TRF1/2 配体TRF-ODN的设计
作者首先对TRF1/2配体进行设计：由三个TTAGGG串联重复序列通过插入“TTT-linker”合成单链（5'- GGGTTAGGGTTAGGGTTATTTTAACCCTAA CCCTAACCC -3'），形成稳定的DNA寡聚体茎环结构（命名为TRF-ODN，图 3A）。为了评估TRF-ODN与TRF1/2蛋白的结合亲和力，作者使用生物素化DNA低聚物作为诱饵进行了链霉亲和素-生物素下拉测定（图 3B、C）。生物素TRF-ODN与TRF1和TRF2结合，可以与游离TRF-ODN竞争（图 3D、E）。
图 3. TRF-ODN与TRF1/2蛋白的特异性结合
2）TeloTAC在多种癌细胞系中诱导 TRF1/2 降解
为了证明TeloTAC在多种癌细胞系中诱导TRF1/2降解的作用，使用TRF-ODN作为配体，构建了TRF1/2的PROTAC（TeloTAC），通过SPAAC反应将它们缀合到VHL E3配体上（图 4A）。作者合成了一系列VHL配体，即化合物1a–18a。除7a–10a外，大多数化合物产率达到了80%以上（图 4A、B）。随后，作者在HeLa细胞中用化合物15b–17b处理，导致显著降解（图 4C），而化合物1b、2b和6b–10b显示出相对较弱的作用。以上结果表明，接头长度和两亲性会影响降解效率。18种TeloTAC对TRF1的降解效率表现出几乎相同的趋势（图 4C）。此外，15b对TRF2的降解被游离TRF-ODN阻断，表明TRF的特异性降解可能以TRF-ODN依赖性方式发生（图4D）。15b介导的TRF2降解被蛋白酶体抑制剂MG132或VHL配体VH-032阻断，表明TeloTAC介导的TRF在TRF-ODN、VHL配体和蛋白酶中依赖性降解（图 4D）。除HeLa细胞外，6b、14b和15b也能有效降解A431细胞中的TRF1和TRF2（图 4E）。TeloTAC 6b、14b和15b能抑制A431细胞的增殖（图 4F），表明这些TeloTAC化合物具有良好的抗癌作用。
图 4. TeloTAC以VHL和蛋白酶体依赖的方式靶向降解TRF1和TRF2
- TeloTAC介导的TRF1/2降解具有选择性抗癌活性
为了研究TeloTAC的抗增殖活性，作者在多种癌细胞系（包括MDA-MB-231、A431和HeLa细胞）中进行了细胞生长曲线、集落形成和MTT测定。
首先，作者发现TRF-ODN、14b和15b能抑制MDA-MB-231、A431 和 HeLa 的细胞增殖（图 5A）。为了进行比较，作者用两种端粒酶抑制剂 RHPS4 和 BIBR1532 处理这些细胞系。TeloTACs 14b 和 15b 的抑制作用强于 TRF-ODN 和两种抑制剂（图 5A）。接下来，作者进行细胞集落形成测定实验来评估TeloTAC对体外癌细胞转化能力的影响。与细胞活力实验结果一致，TeloTAC 14b和15b显着抑制集落形成潜力（图5B），而TRF-ODN的效率相对较低。这些结果表明，TRF-ODN可作为抑制TRF功能的DNA诱饵，而TeloTAC导致TRF蛋白的破坏，因此比TRF-ODN更有效。鉴于癌细胞与正常细胞对端粒酶的生存具有不同的依赖性，作者确定了 TeloTAC 14b 和 15b 在另外两种正常细胞系 LF1 和 MCF10A 中的作用，发现 TeloTAC 14b 和 15b 可有效降解 TRF1/，但对细胞增殖没有明显影响。与此一致，TeloTAC 15b 对 MDA-MB231、A431 和 HeLa 细胞的半最大抑制浓度 (IC50) 分别约为 0.2、0.3 和 0.39 μM，而 15b 对非癌性正常细胞的 IC 50 大约高 10 倍（图 5C）。另一方面，端粒酶抑制剂RHPS4和BIBR1532对癌细胞的IC 50 比15b高约100倍（图5C）。为了进一步证实TeloTAC对癌细胞而非正常细胞的选择性，作者还利用了由GFP标记的HeLa细胞（癌细胞）和mCherry标记的LF1细胞（正常细胞）组成的共培养系统，以显示 TeloTAC 15b 对癌细胞的特异性作用（图 5D）TeloTAC 15b 选择性杀死癌细胞，但不杀死非癌性正常细胞，而端粒酶抑制剂 RHPS4 对这两种类型均显示出非选择性细胞毒性作用。这些结果表明 15b 对癌细胞表现出选择性抗癌活性，同时不影响正常细胞，为 TeloTAC 提供了治疗窗口。
图 5. TeloTAC介导TRF1/2降解导致肿瘤细胞死亡
4）TeloTAC重新部署细胞凋亡和衰老信号
作者尝试使用癌细胞和正常细胞系来描述TeloTAC诱导的细胞死亡机制。先前的报告显示，TERT、TRF1和TRF2高表达且对癌细胞增殖非常重要，而正常细胞不依赖端粒酶生存，表明TRF1和TRF2是有前途的抗癌靶标。因此，作者比较了多种癌症和正常细胞中TRF1/2 mRNA和蛋白水平的表达水平，发现癌细胞比正常细胞表现出更高水平的TRF1/2 mRNA和蛋白（图 6A）。由于TeloTAC显著缩短了癌细胞中的端粒长度，作者接下来研究了TeloTAC治疗是否影响癌症和正常细胞中的细胞衰老和细胞凋亡信号通路。结果显示，TeloTAC（6b、14b和15b）增加了癌细胞中衰老标志物p53和p27的水平，但在正常细胞中没有增加（图 6B）。此外，TeloTAC 在癌细胞中触发了凋亡性半胱天冬酶激活，但在正常细胞中没有，裂解的PARP1和半胱天冬酶3水平的增加证明了这一点（图6C）。因此，作者证实了TeloTAC触发的TRF1/2 降解和随后的端粒缩短重新连接了衰老和细胞凋亡信号通路，以抑制癌细胞而非正常细胞的增殖（图 6D）。
图 6. 与非癌性正常细胞相比，TRF-ODN、6b、14b和15b对癌细胞重新部署细胞信号传导的机制研究
结论
在本研究中，作者验证了 TeloTAC 可选择性降解 TRF1 和 TRF2 并扰乱端粒酶的活性，从而提供一种靶向癌细胞端粒的新方法。TeloTAC 15b 能有效地降解 TRF1 和 TRF2，并具有选择性细胞毒性。然而，由于其基于核苷酸寡聚体设计的性质，TeloTAC 具有一些局限性，特别是在未来的临床转化中。首先，TeloTAC的分子量较大，通常超过10,000 Da，这可能会导致细胞通透性问题。第二，天然核苷酸TeloTAC 的DNA主链易受细胞内核酸酶的影响，从而导致 TeloTAC 的降解。这一缺点可以通过用修饰的核苷酸（例如硫代磷酸酯修饰）替代天然核苷酸来克服。需要进一步优化分子结构以实现更有效的降解。最后，TRF1和TRF2的选择性降解在目前的设计中很难实现，因为这两种蛋白质对端粒DNA具有高度相同的结合位点。这个问题可以通过建立一个DNA文库来筛选每种蛋白质的最佳结合剂来解决，这将为未来DNA诱导的降解提供更适用的工具。本研究中概述的方法将为端粒药物发现提供有利的方法，有可能克服不可成药和耐药目标的挑战。 TeloTAC 展示了针对关键致癌蛋白的原创设计，同时不伤害非癌性正常细胞，并提供了 TERT、TRF1 和 TRF2 作为有希望的癌症特异性靶点的概念证明。
