CELL丨工程化输出RNA用以测量和操纵活细胞
各位老师同学大家好，今天给大家分享的文献来自于Michael Elowitz课题组近期发表在Cell期刊上的工作，题目是《工程化输出RNA用以测量和操纵活细胞》。
作为细胞中的中枢信息载体，RNA为读取和写入细胞行为提供了强大的接口。RNA测序能够读取细胞状态。同时，表达的RNA可用于控制细胞状态。因此RNA是一种理想的检测细胞状态和操纵细胞状态的材料。
作者在这份工作中：构建：1.构建了RNA包装体，分泌的带有RNA的纳米颗粒具有RNA保护性；2.构建能特异性输出RNA的包装体；应用：1.构建的RNA包装体可用于监控细胞群体的动态变化；2.构建的RNA包装体可实现细胞间的RNA输出和表达。
作者选择逆转录病毒的衣壳蛋白用于打包RNA，表达这些衣壳蛋白的细胞能将这些衣壳蛋白自组装从而将RNA打包并分泌出来。作者首先验证逆转录病毒组份可以包装和输出RNA，作者选择MMLV病毒的衣壳蛋白Gag进行包装，并在RNA的3’非翻译区标记包装信号（图1B）。作者将能表达Gag蛋白的质粒和带有包装信号的RNA在HEK293T细胞中顺转，结果显示细胞能分泌出直径在140 nm的病毒颗粒（图1C）。为了评估RNA输出的量，作者通过RT-qPCR的方式检测培养基中细胞分泌出的病毒中的RNA来评价分泌的RNA丰度。这个方法能具有较好的保真性和科重复性。和没有MMLV病毒衣壳的相比，有MMLV病毒衣壳的RNA输出增加了330倍。但是作者也观测到了病毒包裹的RNA有些并不带有包装信号，即MMLV这个系统会非特异性的包装RNA。
为了增加RNA输出的特异性，作者选取了一个MCP蛋白，MCP蛋白能特异性识别名为MS2的RNA序列。作者选取了HIV病毒的衣壳蛋白，并融合了MCP蛋白，形成Gag-MCP衣壳蛋白，这样就能特异性的识别和结合带有MS2序列的RNA。顺转上述体系的HEK293T细胞能分泌直径100 nm的病毒颗粒（图1G）；此外，和不包装Gag-MCP的RNA相比，包装了的增加了850倍。
进一步作者发现虽然Gap-MCP体系确实可以增加体系的特异性RNA输出，但是确实还又非特异性的RNA的包装，由于HIV的衣壳蛋白本身可以结合RNA，因此作者将衣壳蛋白中能结合RNA的锌指区域敲除，但是敲除后RNA病毒包装颗粒就消失了。为了回补，作者将锌指区域换成亮氨酸拉链，组成Gag-Zip-MCP（图1 I），虽然这种亮氨酸拉链能组装成包裹RNA的病毒颗粒，但是产量大大减少。
上述实验证实，通过MML Gag和HIV Gap-MCP包装的病毒颗粒具有较好的产量，但是如果运用到体内治疗还需要有抗酶性以及血清稳定性，因此作者进一步测试这些病毒对RNase的稳定性（图1 L）。结果显示，这些病毒颗粒对其包裹的RNA具有很好的保护作用（图1 L）。
图1.工程化病毒RNA的包装、分泌和RNA的保护
包膜蛋白纳米笼（EPNs）是一类极为理想的RNA输出载体。EPNs由60个亚单位自组装形成十二面体。这种纳米笼可以具有HIV的P6信号肽，因此可以被细胞分泌出来；此外，由于纳米笼的内腔空间较大，是理想的包装RNA的载体（图2A）。
作者将EPNs中的三个位点融合表达了MCP蛋白（图2B和2C），从而能结合带有MS2序列的RNA。当将带有MS2标记的RNA和标记由HIV分泌肽共表达后，HEK293T细胞分泌的RNA病毒颗粒中的RNA量和Gag-MCP体系的一致（图2D、2E）。EPN-MCP体系的RNA病毒颗粒具有较好的抗RNA酶活性（图2F）。
图2. 工程化蛋白纳米笼的包装、分泌和RNA的保护
作者进一步通过RNA-seq的方式去检测病毒颗粒中的RNA组成（图3A）。结果显示，带有MS2序列的RNA的丰度比不带有MS2序列的RNA丰度高1000倍（图3B和3C），证实图1和2中的RNA输出效率。最初的MMLV gag体系中只有4%的RNA是目的输送RNA，而在EPN-MCP体系中，81%的RNA是靶向的RNA。总体来说，GagZiP-MCP和EPN-MCP的特异性RNA输送的特异性最高（图3D）。
为了确定非特异性输出是否偏向于某些转录本而不是其他转录本，作者将输出RNA的组成与细胞聚腺苷酸化转录的组成进行了比较。尽管输出的内源性RNA总量各不相同，但所有前转运体的输出转录组和细胞转录组之间基因的相对丰度密切相关（图3E），表明输出者在转录本中基本上没有偏好性。
图3. 基因组层面对输出RNA的分析
作者还在人类血细胞中测试是否可以分泌这些包装的病毒，包括K562细胞和Jurkat细胞。结果显示在K562细胞中，作者构建的这些病毒包装体系均可以分泌很好的病毒颗粒（图4A），而Jurkat细胞只能在Gag-MCP中有效分泌病毒颗粒（图4B）。上述结果显示，这些病毒包装分泌体系可以在血细胞中实现病毒的分泌。此外，作者还在非人类细胞中比如小鼠的成纤维细胞和仓鼠卵巢细胞中分泌包装RNA的病毒颗粒（图4C和4D）。综上所述，这些结果显示作者构建的这几个RNA包装病毒体系可以在跨哺乳动物细胞进行使用。
图4. RNA输出在不同细胞系和物种间均具有可行性
接下来作者想探索构建的这几个病毒分泌体系是否可以用于细胞群体变化的监测。这种方式只需要收集培养基的上清液检测病毒颗粒中的RNA即可知道细胞群体的变化。为此，作者构建了条形码序列库，并创建了能够诱导导出这些条形码的单元（图5B）。作为基础细胞系，作者在多西环素诱导启动子的控制下将Gag-MCP稳定整合到HEK293细胞中。作者设计了一个慢病毒遗传条形码库，其中包含一个组成型表达的标记条形码RNA，包括一个32核苷酸随机条形码区域和编码荧光反应蛋白报告基因，提供了足够的多样性来标记>104个细胞。
作者制备了两个多克隆细胞群，每个细胞群对嘌呤霉素或博来霉素具有抗性，使用不同的病毒条形码库在这些细胞群中唯一标记细胞，并将每个填充的5000个细胞分选到同一个孔中。然后，作者在嘌呤霉素，博来霉素或两种药物存在下培养这些细胞6天，同时诱导条形码RNA输出。作者每天收集培养物，并通过测序对病毒颗粒中的条形码进行计数。作者发现，细胞培养基中分泌的病毒颗粒RNA和细胞的数量是呈现相关性的，即培养基中病毒RNA的丰度可以代表相对应细胞的数量（图5C-D）。
图5. RNA输出可用于检测哺乳动物细胞群动态变化
作者接下来测试了EPN-MCP病毒体系的第二个运用，即检测细胞间运输RNA病毒颗粒。在EPN-MCP的基础上，作者融合表达了VSVG，用于使分泌的病毒颗粒可以融合进入靶细胞的细胞膜中，从而进行mRNA的递送（图6A）。将分泌细胞和接收细胞共同培养48小时后，作者通过检测接收细胞的递送RNA表达，在这里是红色荧光蛋白的表达来检测是否成功实现RNA的递送（图6B）。结果显示50%的细胞有接收到红色荧光蛋白的RNA（图6C）。进一步，作者也实现了两种RNA的同时递送（图6D和6E）。
图6. RNA在细胞间的递送
之后作者进一步分析细胞间的距离和RNA递送的关系，作者将带有蓝色荧光的发送细胞可以发送Cre重组酶RNA病毒，而接收细胞如果接收到Cre重组酶后则会发出红色的荧光。作者发现这两个细胞间的距离和结果没有相关性，也就是说发送细胞产生的病毒颗粒被接收细胞接收后才会有后续的红色荧光表达的表型（图7）。
图7. RNA在被递送的细胞的表达
综上所述，作者在这份工作中建立了两种高效、高特异性RNA保护性病毒分泌体系，通过构建的这两种体系实现了对哺乳动物细胞群动态变化的监控和通过递送RNA控制相邻细胞。
