JACS丨基于TNA-DNA二价结合体的c-Myc靶向PROTAC治疗三阴性乳腺癌
大家好，今天给大家分享的文献是今年4月份发表在JACS上面的题为《c-Myc-Targeting PROTAC Based on a TNA-DNA Bivalent Binder for Combination Therapy of Triple-Negative Breast Cancery》的一篇文章。本篇文章通讯作者是南京大学的于涵洋教授和南京医科大学附属第一医院的管晓翔教授。于涵洋教授课题组主要以非天然核酸为主要研究对象，开发功能性的非天然核酸，用于肿瘤治疗。
研究背景：
三阴乳腺癌的困境
三阴乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancer, TNBC）是一种缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人类表皮生长因子受体2（HER2）蛋白表达的乳腺癌症的特殊亚型，具有侵袭性强、高度异质性的特点，现有的治疗药物非常有限。
研究表明，c-Myc是TNBC三阴乳腺癌的潜在靶点。c-myc是癌症相关的转录因子，在超过50%的癌细胞中高表达，c-Myc和其相关因子（Max蛋白）形成c-Myc/Max异二聚体复合物，可识别DNA enhancer（E-box，CAC[G/A]TG），调节下游基因的转录。故选择靶向c-myc作为三阴乳腺癌的治疗策略。
但c-Myc表面没有明确的配体结合口袋，属于较难成药靶点。鉴于c-Myc是转录因子，适合作为核酸适体结合的靶标，故选择基于核酸的亲和分子靶向c-Myc。
Scheme：
图1：TEP PROTAC介导c-Myc/Max经蛋白酶体途径降解
在本篇文章中，作者开发了一种c-Myc靶向的TNA Aptamer-E Box-Pomalidomide （TEP）PROTAC分子，构成PROTAC的靶蛋白结合配体是筛选出的非天然核酸TNA-aptamer（threose nucleic acid）与DNA-aptamer结合形成的二价分子，作者在后面的表征中发现，这样构建的分子不仅有良好的稳定性，并且有很好的亲和力，最终使得c-myc通过蛋白酶体途径降解。
结果与讨论：
- TNA aptamer的体外筛选及亲和力测定
图1：双价TNA aptamer-E box (TE)复合物对c-Myc/Max有高亲和力
因为非天然核酸能够抵抗体内天然核酸外切酶的降解，具有良好的生物稳定性，所以作者选择了苏糖核酸这种非天然核酸，进行核酸适体的筛选（图1a）。作者筛选鉴定了能够靶向结合c-Myc/Max复合物的TNA-DNA适体，在筛选过程中，值得一提的是，作者在初始筛选文库的序列设计中，包含了E-box DNA序列，E-box DNA是转录因子结合位点，本身可以和c-Myc蛋白结合，在每轮的筛选中，加入的是非天然核酸tNTP的底物和工程化的聚合酶，这样最终产生了DNA-TNA的二价文库，再进行筛选获得的TNA aptamer E-box DNA，就是可以天然结合c-Myc/Max聚合物的二价分子（图1b）。进行电泳迁移率（EMSA）实验，证明筛选获得的二价亲和分子的亲和力强于单独的TNA-apt和E-box DNA（图1c、d、e、f）。
2.TE结合内源性c-Myc/Max
图2：TE结合内源性c-Myc/Max
为研究TE复合物能够结合内源性c-Myc/Max，制备了带biotin的3种TE分子，并与2种三阴乳腺癌细胞系的细胞裂解液孵育，进行pull down实验（图2a、b），结果表明T1E、T2E、T3E都可以拉下c-Myc/Max复合物。研究可拉下更多c-Myc/Max蛋白的T1E分子的胞内定位，共聚焦结果显示：T1E定位在胞质和细胞核中（图2c、d）。
3.TEP介导细胞内c-Myc降解
图3：TEP介导内源性c-Myc蛋白的降解
鉴于TE分子可以与靶蛋白结合，作者给TE分子连上了E3 配体pomalidomide，构建成了PROTAC分子TEP（图3a），将TEP转染进三阴乳腺癌细胞，发现TEP可高效介导c-Myc的降解（图3b、c、d）；同时通过免疫荧光图像显示，TEP处理显著降低了细胞c-Myc蛋白水平（图3e）。接下来验证c-Myc降解的机制，MG132抑制实验证明TEP经蛋白酶体途径降解，并且加入蛋白质合成抑制剂CH抑制整体蛋白水平的表达时，同时经TEP的处理的细胞c-Myc降低的更快（图3f、g）。
- TEP和Palbociclib协同抑制TNBC细胞增殖
图4：TEP和Palbociclib协同抑制TNBC细胞增殖
作者将TEP与乳腺癌临床治疗药物帕博西尼（Palbociclib）联用，在TNBC的2种细胞系上表现出了协同的抑制肿瘤细胞生长的作用。
- TEP和Palbociclib抑制TNBC肿瘤生长
图5：TEP和Palbociclib协同抑制TNBC细胞增长
在TNBC模型小鼠上，作者将TEP与palbociclib联用，二者协同增效，在小鼠体内抑制三阴性乳腺癌肿瘤的生长。
值得一提的是，作者构建了包载有TEP和palbociclib阳离子脂质体纳米颗粒促进递送，并且在使用cyclic RGDyK肽段修饰脂质体表面，使纳米粒特异性靶向肿瘤细胞。
结论：
总之，本篇文章主要开发了一种基于DNA-TNA的PROTAC分子，可在细胞内特异性降解癌症靶点c-Myc，并与乳腺癌临床治疗药物palbociclib连用，在小鼠模型上有效抑制TNBC肿瘤的生长。为三阴性乳腺癌的化学生物学研究和临床治疗提供了新的手段
