PNAS丨膜透性蛋白对体内细胞间相互作用的遗传解析

本次给大家分享的是发表在Proceedings of the National Academy of Sciences上的一篇文章，题目是Genetic dissection of intercellular interactions in vivo by membrane-permeable protein.     

作者介绍

文章的通讯作者是中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究员。

研究组主要利用基于同源重组酶系统的遗传谱系示踪技术，在哺乳动物体内进行细胞标记及追踪来研究细胞起源及命运，揭示发育、疾病、再生过程中的细胞分化、增殖、衰老、死亡等细胞命运过程，并阐明细胞命运调控的分子机制，为相关疾病治疗提供重要理论基础和新的研究方向。

目前课题组的研究方向主要包括：

①建立和发展谱系示踪及遗传操作新技术，实现哺乳动物体内更为精准、高效地遗传示踪和操作，揭示器官发育与组织再生过程中细胞分化、增殖、衰老、死亡等过程，并阐明其遗传与表观遗传调控机制。

②建立邻近细胞遗传操作新技术，深入解析哺乳动物体内细胞-细胞交流过程，探索体内细胞微环境对干细胞命运调控的机理，为促进体内干细胞有效扩增和诱导分化提供理论基础。

③探索异种器官再造技术，致力于实现重要器官如心脏的异种再造，研究成果将来可以为人类器官再造和移植奠定重要理论基础和技术平台。

背景介绍

细胞通讯是组织维持发育和稳态的基础。在组织功能适当的部位，细胞通过物理相互作用进行通讯,形成细胞网络。细胞功能不仅由细胞本身决定，还会因其微环境的不同而行使不同的功能。

细胞-细胞相互作用在许多生理和病理过程中是指导细胞行为的必要途径，最近已经报道了几种方法来剖析细胞相互作用。开发ProximID以分选和分析彼此附着的相邻细胞。基于物理接触，合成Notch受体也用于标记和操纵相互作用的细胞。此外，细胞穿透荧光蛋白也已用于通过细胞移植标记小鼠中的肿瘤微环境。反式-Tango、TRACT和BAcTracer用于果蝇中的跨突触标记，为神经元回路分析提供了灵活的平台。

Cre重组酶

周斌研究组利用Cre重组酶研究细胞间的相互作用。Cre重组酶源于P1噬菌体，由343个氨基酸组成，相对分子质量为38 kD。Cre重组酶由较大的C末端结构与和较小的N末端结构域组成，结构域之间通过短链相连。110个氨基酸组成的N末端结构域形成A、B、C、D、E五个α螺旋，螺旋A、E参与四聚体的形成，螺旋B、D参与 LoxP位点的结合。 （如图1）

图1  Cre重组酶结构

Cre酶可以识别特异DNA序列，称为LoxP位点，它由34 bp组成，由两个13 bp反向重复序列和一个不对称的8 bp间隔区组成（如图2）。间隔区两侧13 bp反向重复序列是Cre重组酶识别和结合的位点，8 bp的间隔区是DNA链断裂与连接等重组过程发生的区域。LoxP位点间隔区的不对称性决定其重组的方向性。

图2  LoxP结构

当两个LoxP位点方向相同时，在Cre重组酶的介导下，LoxP位点之间的序列会被删除（Deletion）（图3A）；当两个LoxP位点方向相反时，在Cre重组酶的介导下，LoxP位点之间的序列会被倒位（Inversion）（图3B）；如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位，即基因转座（Translocation）（图3C）；如果四个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导LoxP间的序列互换（cassette exchange）（图3D）。

图3  Cre识别剪切LoxP示意图

周斌研究组开发了一种称为CILP的方法，允许在细胞类型特异性Cre的控制下驱动特异性sLP-mCherry表达（如图4）。在R26-sLP-mCh-GFP小鼠体内注射特异靶向肝细胞的病毒AAV2/8-TBG-Cre，当病毒进入肝细胞后，Cre重组酶表达并发生Cre-LoxP重组，移除R26-sLP-mCh-GFP位点中间的终止序列，启动表达sLP-mCh和GFP荧光蛋白，成为sLP-mCh的供体细胞。

图4  CILP原理示意图

CILP可以应用于多器官系统

研究发现，肝细胞为GFP⁺ mCherry⁺，同时能检测到GFP^- mCherry⁺的非实质细胞，肝脏中80%内皮细胞、76%免疫细胞以及54%成纤维细胞被标记。此外，还可以在GFP⁺ mCherry⁺供体腺泡细胞、GFP⁺ mCherry⁺供体心肌细胞附近检测到GFP^- mCherry⁺受体细胞（图5 B和C）。这些例子表明，CILP可以应用于多器官系统。

图5  CILP应用于多器官系统

CILP 检测肝细胞及其邻近内皮细胞的相互作用

研究组还研究了肝细胞及其邻近内皮细胞的相互作用。肝脏的基本单位是肝小叶，肝小叶可分为三个区域（zone），各区域的肝细胞具有不同特性以及分子标记（如图6）。一区的肝细胞围绕着肝脏门静脉，高表达钙粘蛋白E（E-Cad）；三区的肝细胞围绕着肝脏中央静脉，高表达谷氨酰氨合成酶（GS）；肝小叶二区位于一区和三区之间，由E-Cad-G的肝细胞构成。肝脏不同区域的细胞可能会受到内皮细胞不同程度的影响。

采用他莫昔芬（Tam）诱导Cre的重组活性（如图7），在没有他莫昔芬的情况下，CreER融合蛋白与热休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于细胞质中。给予他莫昔芬药物处理会破坏HSP90与CreER的相互作用。ER与Tam的相互作用诱导Cre的核易位。在细胞核中，CreER识别LoxP位点，使组织X中的基因Y失活。

图6  肝小叶基本结构

图7  Tam诱导表达Cre

利用CILP标记Mfsd2a⁺肝细胞附近的内皮细胞，生成了双基因型Mfsd2a-CreER、R26-sLP-mCh小鼠，经Tam诱导sLP-mCherry表达，成为供体细胞。研究组发现门静脉周围的肝细胞表达mCherry，导致随后标记周围的非肝细胞，包括CDH5⁺内皮细胞（图8A）。sLP-mCherry的扩散距离约为50 µm，厚度约为2至3层肝细胞（图8B）。定量显示，区域1中>90%的内皮细胞和区域2中约30%的内皮细胞是mCherry⁺，而区域3中的内皮细胞很少被标记（图8C.D）。对于每个区域中的内皮细胞，在Tam诱导后3周和6周收集的样品之间，其标记效率没有显著差异（图8D）。这些数据表明，肝脏中的内皮细胞群体可以被CILP靶向，可用于研究与其相邻肝细胞的潜在通信（图8E）。

CILP检测肝脏不同区域内皮细胞的差异

进一步研究肝脏不同区域内皮细胞的差异，FACS分离和随后的RNA测序分析显示，mCherry⁺ 内皮细胞与mCherry^- 内皮细胞明显不同（图9 B.C）。具体而言，门静脉周围标志基因包括Dll 4、Lama 4、Msrl和Ltbp 4在mCherry ⁺ 内皮细胞中上调，而中心周围标志基因如Rspo 3、Wnt 9 b、Cdhl 3和Thbd在mCherry⁺ 内皮细胞中下调（图9D）。进一步的分析表明，参与血管生成、细胞粘附调节和对生长因子响应的基因在mCherry⁺ 内皮细胞中显著上调，而与细胞外基质组织、趋化性和组织形态发生相关的基因显著下调（图9E）。上述数据表明，Mfsd2a⁺肝细胞的邻近内皮细胞可以被特异性地鉴定并分离，用于通过CILP进行进一步分析。

图8 肝细胞及其邻近内皮细胞互作

图9 肝脏不同区域内皮细胞的差异

总结

综上，周斌研究组开发了体内邻近细胞标记新技术CILP。CILP利用细胞膜透过性的荧光蛋白，当这种荧光蛋白在供体细胞中表达后释放到细胞外，并被邻近细胞摄取，实现标记邻近细胞目的。结合Cre小鼠系，课题组设想通过CILP靶向特定环境中的相邻细胞，将提供一个平台来理解小鼠中以时空方式在细胞间的相互作用。