Science | 官能团指导的小分子适配体筛选

    今天分享的是2023年6月发表在Science上的一篇文章，标题为A functional group–guided approach to aptamers for small molecules。

有关作者：

        本文的通讯作者为Columbia University Irving Medical Center的Kyungae Yang和Milan N. Stojanovic教授，其研究方向包括分析体液样品的高分辨率传感器阵列、分子自动装置等。

研究背景：

        适配体是由随机文库在靶标存在下经过多轮富集再放大得到的寡核苷酸受体，可以被工程化改造为荧光、电化学或者电子传感器。适配体在生物传感上的应用受限于靶向小分子的适配体种类。在经典的适配体筛选方法（图1B）中，含有36 nt随机寡核苷酸的文库通过5′端与capture sequence杂交，从而被固定；靶标与潜在适配体的结合将把后者从固定相置换下来。作者发现通过经典的筛选方法无法得到亮氨酸和伏立康唑（图1A）的适配体。这两种靶标均含有拥挤的sp3杂化的碳原子。因此，作者试图探究靶标结构与筛选结果的关系、开发具有普适性的适配体筛选方法。

结果与讨论：

        作者首先探究了靶标分子结构与寡核苷酸置换自由能的关系。本文集中研究了28个适配体，其靶标为胺、氨基酸以及其类似物。过往的研究多采用适配体与靶标的结合自由能∆G_B衡量亲和力，而本文则通过靶标把适配体从固定相置换下来的自由能∆G_D表征靶标对capture sequence的竞争力，后者可用于粗略估计某一靶标适配体筛选的难易程度。相应地，^appK_D描述了capture sequence与文库的结合与解离（K_A）以及文库与靶标的结合与解离（K_X）两个平衡（图1C）。以甲胺和苯乙胺为例（图1D），作者将两者∆G_D相减得到苯甲基对适配体结合自由能的贡献∆∆G_BE，并进一步提出不同官能团对适配体结合的协同效应：如图1E所示，当向甲胺分别加上苯甲基和羧酸盐得到苯基丙氨酸时，∆∆G_BE为-19.3 kJ/mol; 而直接计算苯基丙氨酸和甲胺之间的∆∆G_BE则为-11.3 kJ/mol，二者之间相差的+8 kJ/mol说明苯甲基和羧酸盐之间存在负的协同效应，两者的同时存在不利于适配体与靶标的结合。

图1. 适配体文库结合目标官能团的自由能分析。

        基于上述猜想，作者对27个适配体的∆G_D与∆∆G_BE进行了分析（图2）。他们发现从4次独立的筛选中得到的苯基丙氨酸适配体具有相近的∆G_D（图2B），说明该筛选方法具有很好的可重复性，也侧面反映∆G_D应该与官能团而不是筛选相关。随后，作者通过对图2A靶标适配体的筛选得到各靶标结合适配体的∆G_D，发现疏水基团中重原子个数的增加更有利于靶标与适配体的结合（图2B）。接着，作者通过各靶标∆G_D的差值推断出不同官能团的∆∆G_BE （图2D），并且在N-乙酰-5-甲氧基色胺的适配体上得到验证（图2C）。作者发现，某些官能团（例如疏水基团与带负电的基团）之间具有负的协同效应，其同时存在将使得靶标更难与适配体结合。

图2. 27个适配体的∆G_D与∆∆G_BE分析。

        在建立上述理论之后，作者推测此前亮氨酸适配体难获得的原因是亮氨酸的两个平面外碳原子和羧酸盐相互靠近，降低了适配体与其结合的接触面。为了克服该困难，作者将亮氨酸拆分为异丁基与α-氨基酸羧酸盐两部分（图3A），分别对其进行筛选。作者首先筛选了能够结合Cp*Rh(III)的适配体CpRh1.0作为“占位者”，将随机的22-nt序列插入CpRh1.0，加入亮氨酸和Cp*Rh(III)筛选得到具有异丁基结合片段iBu.1的适配体（图2B）。接着，作者将iBu.1与随机的22-nt文库相连，用亮氨酸洗脱，得到结合亮氨酸的适配体Leu2.1（K_D ~ 10 mM）。该适配体较低的亲和力也与羧酸盐和异丁基之间较强的负协同效应相关（图3C）。为了得到亲和力更高的适配体，作者引入Cu(II)与羧酸盐络合，使得疏水的DNA单体更好地与亮氨酸侧链结合。由此得到的适配体对亮氨酸具有较好的亲和力（K_D ~170 nM）。

图3. 通过官能团指导的多步筛选获得亮氨酸适配体。

        最后，作者也基于结构筛选了伏立康唑的适配体（图4）。伏立康唑的结构较为拥挤（图4A，分子2），不利于与DNA疏水表面的结合。于是，作者试图利用空间相对松散的伏立康唑类似物（图4A，分子2a）辅助筛选。在最初的筛选轮次中，作者将伏立康唑及其类似物以最大溶解浓度混合，以增加靶标结合后适配体从固定相脱离的概率，再在后面的筛选轮次逐渐降低类似物的浓度。利用上述方法，作者得到了伏立康唑及其类似物的两个适配体（图4B），还将该适配体改造为FRET响应的传感器。

图4. 利用类似物筛选伏立康唑适配体。

总结与展望：

        本文建立了靶标-适配体结合能力与官能团之间的关联，开发了基于官能团的适配体筛选策略：（1）将文库插入已知适配体；（2）基于官能团片段筛选；（3）利用金属配合物“保护”负协同效应官能团之一；（4）引入“占位者”、连接基团；（5）利用更简单的类似物克服空间位阻、溶解性等问题。

        本文用利用官能团筛选适配体的策略也可以倒过来，利用结构信息和大量适配体信息筛选靶向天然核酸的小分子药物。此外，本文开发的适配体-靶标对也可以用于提升电脑辅助适配体设计的训练集。

K. Yang, N. M. Mitchell, S. Banerjee, Z. Cheng, S. Taylor, A. M. Kostic, I. Wong, S. Sajjath, Y. Zhang, J. Stevens, S. Mohan, D. W. Landry, T. S. Worgall, A. M. Andrews and M. N. Stojanovic, Science, 2023, 380, 942-948.

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abn9859