ACS NANO | 使用自动化单粒子拉曼分析揭示基于囊泡的纳米药物的群体异质性
大家好，今天跟大家分享的是 Molly M. Stevens教授发表在ACSNANO上的一篇文章。
作者介绍
首先介绍一下这篇文章的作者Stevens教授。Molly Stevens教授是帝国理工学院生物医学工程研究所生物医学材料科学研究室的主任，科研界公认的模范人物（TED2013茉莉史蒂芬: 培育骨骼的新方法），2010年被时代周刊评价为40岁以下科学家世界TOP10。
本科就读于巴斯大学（Bath University）药物科学专业，博士就读于诺丁汉大学，研究方向是生物物理，关注于特定生物分子间的相互作用以及单个生物分子的结构，其后在麻省理工学院Robert S. Langer 从事博士后研究。2004年加入帝国理工学院，建立了一个非常大且非常成功的研究组，她主攻生物医学材料和再生医学方向。主要研究方向：1、干细胞分化，新型生物活性支架设计和组织工程新方法。2、生物分子识别和自组装机制制备纳米材料、生物传感器以及药物释放系统。
背景介绍
体内纳米医学行为，如药代动力学和毒性，受到纳米颗粒理化性质的影响强烈，而理化性质又取决于纳米颗粒潜在异质性。
迄今为止，标准纳米材料表征技术（如DLS、HPLC），尚未充分描述颗粒间的异质性。同时，许多单颗粒技术（电子显微镜）通量低，因此无法测量足够的颗粒来提供具有代表性的人群水平信息，并且药物的可视化通常具有挑战性。基于荧光的技术，如凸透镜诱导约束（CLiC）和荧光相关光谱（FCS），为染料、siRNA和蛋白质的定量上样信息提供了高灵敏度。此外，纳米流式细胞术（nano-FCM）可以检测核酸和阿霉素等荧光货物的装载行为。但是，这些荧光依赖性技术需要优化标签策略或固有荧光货物。此外，标记小分子显着改变其物理化学性质，因为染料标记占整个分子的很大一部分。因此，纳米药物内的分配和异质性及其对下游效应（如稳定性和释放）的影响无法准确确定。
纳米制剂应用于临床需要为制造质量控制、监管机构的表征提供信息，并将纳米制剂的特性与临床结果联系起来，以实现合理的设计。
内容简介
一种可以记录无标记、非破坏性、天然状态化学信息的替代技术是拉曼光谱。拉曼光谱可以与光学捕获相结合，其中单个颗粒稳定地保持在聚焦激光束的共聚焦体积中，并同时记录其拉曼光谱。激光快门后，颗粒扩散开来，另一个颗粒被困在共聚焦体积中。以前，这种捕获和颗粒释放是手动完成的，导致每个样品通常<10个颗粒的低通量。最近开发的单颗粒自动拉曼捕获分析（SPARTA）平台已经使该过程自动化，每小时可以测量几百个颗粒。
作者设计并合成了一个具有相似化学结构但亲水性增加的模型货物库。将这些货物以递增的浓度装载到由PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA制备的模型聚合物体中。然后用SPARTA测量这些负载的聚合物体，以获得有关聚合物载体的无标签，高通量信息，并在单个颗粒水平上对货物进行建模。最后，作者将该模型应用于其他系统，包括加载到脂质体中的模型货物，负载氯喹（CQ）的脂质体以及商业基于脂质的化疗Doxil，证实了该方法的广泛适用性。
方法与讨论
模型载货运输系统设计与开发
为了创建一个系统分析货物装载位置和异质性的模型，作者首先设计了一系列具有递增亲水性和独特拉曼峰的小分子模型货物。所有模型货物分子都基于相同的对称的1,4-二苯基-丁-1,3-二烯基团，以减少空间位阻和π-π堆积等化学因素的变化，从而主要关注货物亲水性对装载行为的影响。对称二元炔在拉曼静默区域具有强烈、明显的对称C≡C拉伸振动模式，这提高了灵敏度，并很容易在拉曼光谱中区分货物和载体。加入苯基端封基团提高了化学稳定性，并进一步增加了拉曼信号。作者通过修改苯基的对位取代基来调整亲水性。然后使用Glaser-Hay耦联合成了5个成员库，这是一种Cu催化的末端烷炔烃同质偶联，可用于二炔烃合成。使用核磁共振、质谱法（MS）和拉曼光谱证实了合成和纯化成功。
随后，作者将这些模型货物化合物装入由两亲性三嵌段共聚物PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA形成的囊泡体中。使用薄膜再水化和挤出制备了每种装载模型货物的浓度为0.1、0.5、1、1.5和2 mM的囊泡。疏水性货物Et、COOMe和NH2用PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA干燥成薄膜，然后用DPBS再水化。亲水性货物NMe3和SO3溶解在DPBS中，DPBS仅用于对囊泡膜进行再水化。通过100nm孔径膜搅拌和挤出过夜后，通过尺寸排除色谱法（SEC）将装载的囊泡体与游离货物分离。
为了表征囊泡特性，作者采用了动态光散射（DLS）、ζ电位和低温透射电子显微镜（cryo-TEM）。DLS显示，囊泡是单分散的，在以不同浓度装载不同模型货物时，平均尺寸均相似为约150纳米（图1b）。装载不同货物的囊泡体的ζ电位（图1c）是均中性的（-4.5-0.3 mV），这表明囊泡表面电荷是中性的，跟之前报道一样。空囊泡体的低温TEM图像主要显示囊泡结构，当囊泡加载NH2和NMe3时，囊泡结构依然是保守的（图1d）。低温TEM显示，囊泡的平均膜厚度为13.7 ± 1.7纳米。虽然低温TEM可以揭示详细的单囊泡形态特征，但作者进一步使用小角中子散射（SANS）来表征空、Et和COOMe负载囊泡的体积级粒径和膜厚度（图1e）。作者使用SASView v5.0.4将SANS曲线与核壳椭球模型相匹配，该模型为所有样品的半径为83-86纳米，膜厚度为14-15纳米，与低温TEM和DLS一致，确认了囊泡形态，并表明货物装载后可忽略不计的变化。
图1
随后，使用SPARTA对囊泡化学和负载进行了表征。在每次测量中，大约200-300个粒子被单独光学捕获，同时记录其特定的拉曼光谱。装载2 mM Et的所有测量囊泡的平均拉曼光谱（图1f）展示了了来自囊泡和货物的强烈信号。主要囊泡峰包括来自疏水性PDMS块的Si-C拉伸为708厘米-1，重叠的CH2/CH3变形为1411-1437厘米-1。Et模型货物的峰值包括1601厘米-1的芳香环和2220厘米-1的主二环二烯振动。所有货物都存在特征囊泡峰以及类似的峰，这意味着每批货物都成功装载到囊泡中。并且二炔峰强度与货物疏水性没有很强的相关性。为了进一步调查货物装载行为，作者检查了拉曼峰面积，以推断初始浓度增加时货物模型的相对数量（图1g）。
在所有浓度中，货物Et的二炔峰面积恒定在∼60。Et上的疏水性乙基取代基表明在膜中具有很强的分布。尽管初始浓度不断增加，但对于Et的恒定浓度，作者提出了两种可能的解释。首先，可能是Et的高疏水性，囊泡-货物相互作用不如货物-货物相互作用那么有利，这意味着囊泡膜饱和在0.1 mM浓度以下，多余的Et析出出来，并在纯化过程中被去除。其次，囊泡自组装的动力学可能比薄膜中0.1 mM以上的货物沉淀要慢，其结果与多余的货物沉淀而没有加载到囊泡相同。与此同时，疏水性较低的化合物COOMe和NH2都显示，二炔峰面积依次增加，浓度分别从8到31和40到101（图1g）。虽然这些货物预计也会被分流到膜中，但随着进给量的COOMe和NH2拉曼信号的增加表明，它们的疏水性较低，与PDMS的相互作用更有利。这导致更高的负载和增加的进给比。
另外两批亲水货物NMe3和SO3随着初始货物量的增加，也显示出二炔峰面积的增加，但在2至10内，其规模远低于其他货物（图1g）。这些差异可能是由于货物化学成分的差异影响了装载方法和位置。由于其亲水性，NMe3和SO3应该主要加载到囊泡核心中。众所周知，与将疏水性货物装载到膜中相比，将亲水性货物被动装载到纳米囊泡的水芯中与较低的封装效率有关，因为后者会因与水的不利相互作用而主动装载。这解释了NMe3和SO3的二烷峰面积比其他货物低得多，而初始装载率相同。然而，随着货物浓度的增加，峰面积依次增加，验证了这些亲水货物仍然加载到囊泡体中。虽然检查SPARTA的平均拉曼光谱已经揭示了基于不同化学成分的货物装载差异，但SPARTA的真正优势在于能够测量单个囊泡数据。因此，作者接下来通过关联纳米载体和货物的每个囊泡的信号来进一步详细分析单个囊泡水平的信息。
单个颗粒的群体分析可以区分膜和核心负载
SPARTA数据呈现了一个大型的多维数据集，由5个浓度的5种模型货物的∼200个囊泡的拉曼强度组成，范围为∼1800厘米-1。因此，为了提高可解释性，作者引入了一个数据缩减的分析框架。拉曼数据缩减以前是通过多元技术实现的，例如主成分分析（PCA）和偏最小二乘法（PLS）。可以利用在每个囊泡光谱中观察到的强非重叠708厘米-1 PDMS峰值（囊泡主信号）和2220厘米-1的二炔峰（货物主信号）（图2a）。然后创建散点图，其中每个点代表单个囊泡的峰值面积（图2b）。由于拉曼光谱的性质，增加的拉曼强度大致对应于增加分析物的量。因此，散射图中沿x轴的分布（图2b）对应于由于囊泡直径，多层性或囊泡结构增加而导致的每个囊泡的膜量变化，如冷冻透射电镜图像中观察到的那样（图1d）。同时，y轴分布描述了每个粒子中的相对货物量。这种的散点图使作者能够可视化 ∼300 个单个囊泡中每个囊泡的货物量随囊泡量的变化。对于没有装载的囊泡，所有光谱在货物主信号区域（2208/2220 cm–1 ）均显示平坦分布(图2b）。加载货物的样品，例如，1 mM NH2囊泡和货物峰面积之间显示出很强的正线性相关性（图2b）。因此，在这种疏水货物的情况下，含有较高量的囊泡膜的囊泡装载的货物量较高。
图2
为了理解散点图中的数据，作者进行了简单的理论建模，以预测在核心和膜负载的情况下纳米载体和货物质量之间的关系（图2c）。这对应于SPARTA中 708 cm-1的散点图PDMS峰面积（载体）与2220 cm–1的二炔峰面积（货物），因为拉曼信号与分析物量广泛相关。当货物在囊泡形成过程中装载时，疏水和亲水货物表现出不同的装载行为。在能量上不利于高度疏水的分子在缓冲液中溶解，因此它们在膜中表现出强烈的分配，这可能导致包封效率接近100%。为了捕获疏水货物的这种加载行为，作者计算了半径从25到300 nm增加的单层囊泡的预期膜质量，并使用囊泡：二炔烃浓度质量比来计算每个囊泡的疏水货物的预期量。另一方面，亲水性货物主要存在于缓冲液中，因此它们的装载效率受到其纳米囊泡核心内捕获的体积的限制。因此，为了描述核心负载，作者计算了半径增加的纳米囊泡的核心体积，并使用样品浓度来计算得到的封装货物质量。
结果表明，对于膜负载，PDMS与货物质量之间存在正线性相关性，而对于核心负载，立方关系要低得多（图2c）。这与负载了越来越多的疏水性NH2(从0.1到2mM)的囊泡的实验观察到的散点图密切相关从0.1到2mM（图2d）。相比之下，亲水货物NMe3和SO3在散点图中显示较低的货物信号。随着初始加载比从0.1增加到2 mM，SO3的货物峰值区域的平坦分布逐渐增加从2到6，NMe3的4到10,这与核心负载的建模部分一致。
在确定可以根据主要货物装载位置从囊泡-货物峰面积散点图中定性区分核心和膜负载（图2 d）之后，作者引入了半定量测试来区分这些负载行为（图2e）。核心货物 NMe3和SO3在货物运输散点图中形成近乎平坦的分布，这意味着从线性拟合来看，梯度低于 0.2，相关系数 R2均低于 0.11。相反，膜负载NH2货物在囊泡和货物峰面积之间形成正线性相关，产生1.3–2.7的梯度和R2梯度为0.35–0.86。需要注意的是，两种较高浓度的NH2，1.5和2 mM，形成更多的分散群体（图2d），可能是因为膜正在饱和，导致负载分散度增加和R2降低。尽管如此，在不同浓度下绘制SO3、NMe3和NH2负载的囊泡的梯度和R2可以明确区分核心和膜负载：核心负载粒子落在左下象限，而膜加载粒子出现在右上象限（图2e）。
为了可视化和确认货物装载位置并验证作者在纳米囊泡上进行的方法，作者对微米级的巨型囊泡体进行了2D共聚焦拉曼成像（图3）。装载着NH2的大囊泡清楚地显示了二炔（货物）和囊泡膜的共定位。相比之下，亲水性SO3在巨型囊泡核心中检测到。在绘制出纯水光谱后，作者从这些拉曼图像中重建了囊泡和货物峰面积之间相关性的散点图。但是，这里的每个点代表图像中的一个体素，而不是一个囊泡（图3）。正如预期的那样，空囊泡在纳米载体和货物之间没有相关性。NH2装载的囊泡显示出囊泡和货物之间的线性相关性，这意味着货物在显微镜的分辨率内与膜共定位，这与作者对装载相同货物的纳米囊泡的SPARTA分析一致。
图3
不同货物引起的种群异质性
为了检查Et和COOMe负载行为，用SPARTA测量将囊泡体装载的货物浓度从0.1增加到2 mM 的Et和COOMe。装载有 Et 和 COOMe 的囊泡的 SPARTA 散点图（图 4a）显示，装载行为与上一节中描述的SO3、NMe3和NH2模型货物的装载行为大不相同。对于各种梯度浓度，Et 和 COOMe 负载囊泡形成了货物和囊泡之间线性相关的主群体，表明均匀加载到膜中，如膜加载 NH 2所示（图2d）。然而，对于高于0.5 mM的负载比，Et和COOMe负载形成了一个囊泡亚群，相对于该囊泡中的囊泡量而言，具有高量的货物（图4a）。因此，作者决定进一步调查SPARTA数据揭示的亚群。
图4
作者对 Et 和 COOMe 的每个负载比率分别运行了 2 个因子的 NNMF。在作者的NNMF模型中，因子1（W1）类似于空囊泡光谱，而因子2（W2）类似于货物光谱（图4b）。在0.5 mM负载以上，分选到簇1的囊泡属于线性区域，而分类到簇2的囊泡是高负载囊泡（图4a）。然而，对于 Et 和 COOMe 在 0.1 mM 时，聚类是基于囊泡的量，例如更大或更多的多层囊泡，而不是囊泡中的货物量，因为在此浓度下没有足够的高负载囊泡来形成单独的亚群（图 4a）。因此，作者设计了一个简单的测试来确定NNMF是否可以从SPARTA数据中检测出单独的亚群。运行NNMF后，作者在两个因素之间的二环烃峰区域（2184–2235 cm-1）中发现了均方根误差（RMSE）。作为对照，作者还比较了NH2负载囊泡的RMSE值，作者之前发现这些囊泡只形成一个种群（图2d）。当只有一个亚群形成时，在0.1 mM 浓度的Et和COOMe，以及NH2的所有浓度，RMSE低于0.33，而亚群的RMSE高于0.86（图4c）。
作者量化了识别出亚群的高负荷囊泡的百分比，以及随货物浓度的变化情况（图4d）。对于Et，在所有浓度中，高负载囊泡的比例稳定在8-13%。对于COOMe，货物浓度从0.1 mM增加到2 mM的过程中，高负载囊泡从5%普遍增加到36%。因此，尽管在较高的负载比下，平均COOMe负载量高于Et（图1g），但高负载囊泡的比例更大，这与检查临床纳米制剂的毒性差异有关。
除了确定高负载囊泡的比例外，作者还评估了它们的物理来源。在两个负载比中，集群2中的高负载粒子显示，二炔峰位的偏移较低，为2217cm-1（图4e）。高负荷囊泡的这种较低的峰值位置与2214cm-1的粉末状态峰值位置更相似。同样，第1组中的COOMe负载囊泡分别显示0.5和1 mM负载的平均货物峰值位置为2221和2220厘米-1，而高负载粒子子群的平均二环峰位置为2218厘米-1，再次接近COOMe粉末记录的2216厘米-1峰值位置（图4e）。
集群1囊泡的较高二炔峰位置表明，该囊泡亚群中的货物分子与高负载粒子亚群中的低波数二炔化合物处于不同的环境。可能是集群1货物分子主要溶解在膜中，而高负载囊泡含有货物的纳米聚集体。这种行为可能与货物-货物和货物-囊泡相互作用的平衡有关，其中Et和COOMe货物经历了更强的自我相互作用，因此更有可能堆叠而不是均匀结合在囊泡膜中，并且作者在支持信息中验证了猜想。
将该模型应用于各种纳米囊泡系统
作者测试了该模型是否可以描述囊泡体以外的纳米载体中的药物负载。许多批准的配方含有磷脂酰胆碱（PC）头基和胆固醇（CH）的脂质，因此作者以4：1的摩尔比制备了具有二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）：CH的脂质体。作者用1 mM Et、NH2和SO3装载脂质体，在囊泡模型系统中分别表现出异质、膜和核心负载，以测试货物在不同的纳米载体中是否表现相似。作者将脂质体挤出通过孔径为100 nm的膜，形成平均尺寸为∼110 nm且PDI<0.1的囊泡，因此这些囊泡的尺寸分布与Onivyde和Doxil等商业配方相似。然后作者用SPARTA测量脂质体。
图5
SPARTA表征中所有囊泡的平均拉曼光谱显示，二炔峰在Et和SO3为∼2220厘米-1，NH2为2208厘米-1，表明加载成功。主要脂质峰值包括1295厘米-1 CH2扭曲/wag和1440厘米-1 CH2变形。在作者分析SPARTA数据后，发现模型货物在脂质体中的负载行为与之前在囊泡体系统中看到的相似（图2和图4）。因此可以使用脂质1295厘米-1和二炔峰区域形成散点图。大多数负载有Et的囊泡（由NNMF确定为73%，图5b）形成了一个亚群，其中货物量随脂质量线性增加。剩余的Et负载囊泡形成了一个高负载的亚群。两个聚类之间的RMSE为2.1，在作者的分析框架内确定了两个亚群的存在。NH2负载脂质体仅形成一个群体，其中货物和载体的数量线性增加，梯度为1.1，相关系数为0.6，根据作者的模型，表明膜负载均匀（图5b）。SO3-负载脂质体形成梯度为-0.1且相关系数为0.2的平坦分布，这属于核心负载类型（图5b）。因此，尽管DPPC和PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA具有不同的化学和机械特性，但模型货物在脂质体和囊泡体中的表现相似。因此，作者验证的模型可以应用于描述不同纳米载体系统中的负载。
然后，作者将分析方法应用于纳米配方开发中的典型问题，即测试不同配方的释放。制备脂质组成DPPC：CH 4：1 mol %的脂质体，在囊泡形成过程中被动负载50 mM氯喹（CQ-lip）。作者根据文献选择了这种纳米制剂，类似的制剂在几个小时/几天内泄漏，这将使作者能够测量药物分布的变化。然后，将制剂在48°C下透析37小时，并在不同的时间点测量DLS和SPARTA。DLS表征证实，在48小时内，囊泡保持稳定的尺寸分布，平均直径为208 nm，PDI低于0.2（图5d）。SPARTA表征的平均拉曼光谱显示，氯喹在1375 cm-1处达到峰值，源自重叠的 C═C、N-H 和 C-H 键，在48小时孵育期间，强度从0.26依次降低到0.10（图5e）。
然后，作者通过绘制每个时间点所有囊泡的1295厘米-1峰区与氯喹1375厘米-1峰区的值，绘制了每个测量粒子的脂质和药物含量之间的相关性（图5f），这与上面的散点图类似（图2和图4）。CQ-lip显示脂质载体与氯喹货物之间的相关性较低，类似于核心负载SO3和 NMe3模型货物。将之前的模型框架应用于这些散点图，发现梯度从 0.0 到 0.2 和 R2值低于 0.26（图 5i）。此外，所有时间点的RMSE均低于0.02（图5j）。作者之前的模型证实，囊泡均匀地加载核心，并在48小时内在整个体系中一致地释放药物。这证实了作者的分析框架适用于捕获货物放行期间药物分布中的高通量、单囊泡变化。
为了与CQ-lip释放曲线进行比较并证明对商业制剂的适用性，作者研究了Doxil的释放，Doxil是第一个FDA批准的脂质体产品，它是一种高度优化的配方，含有抗癌药物阿霉素。作者测试了SPARTA在高胎牛血清（FBS）浓度（50%，75%和90%v：v）下测量Doxil的能力，因为这更能代表体内条件。即使在90%（v：v）的最高血清浓度下，作者也可以看到捕获峰和囊泡相关峰.
在48°C透析37小时内，Doxil在平均直径为97nm时保持尺寸稳定，PDI低于0.1（图5d）。所有囊泡的平均SPARTA光谱在1208和1242 cm-1处显示出强烈的阿霉素峰，来自重叠的 C-O、C-O-H 和 C-H 弯曲（图 5g）。然而，与CQ-lip相比，Doxil峰强度在48小时内没有降低。作者绘制了 1295 cm–1脂质峰面积相对于 1208/1242 cm–1阿霉素峰面积（图5h）。与CQ-lip类似，Doxil配方显示出低梯度（0.3–1.0），纳米载体与货物量之间的相关性很小（R2值 0.0–0.1）（图 5i）。这可以通过Doxil的主动负载来解释，它导致核心负载以结晶形式与货物一起。这表明阿霉素晶体尺寸的变化与囊泡膜量没有很强的相关性。RMSE对NNMF聚类的评估在所有时间点均低于0.09，证实在整个释放研究中只有一个群体（图5j）。总体而言，作者的分析表明，在48小时内，药物主要包含在Doxil的核心中，没有显着释放。这与先前的报道一致，即在48°C的血浆中孵育37小时后，仅释放了10%或<5%的阿霉素。
因此，作者的建模可以帮助解释两种不同纳米制剂的配方异质性和药物释放。CQ-lip和Doxil主要由核心负载药物组成，在药物负载方面具有单个囊泡群。虽然氯喹在48小时内从CQ-lip中检测到释放，但Doxil在测试期内没有释放大量药物。这是由于与CQ-lip相比，Doxil脂质膜中的胆固醇百分比更高（38%与20%相比），并且Doxil中的药物是结晶形态而CQ-lip中的药物是溶液形态。因此，这个方法可以通过跟踪药物分布在单个囊泡水平上随时间的变化来区分不同纳米制剂的稳定性。
