Mol Cell | 无CRISPR可编程RNA假尿苷化抑制提前终止密码子
大家好，今天给大家分享的这篇文献是2022年12月发表在Molecular Cell上的文章，题目为CRISPR-free, programmable RNA pseudouridylation to suppress premature termination codons。本文的通讯作者是北京大学的伊成器教授。伊教授的研究方向是RNA/DNA修饰的生物学通路、功能和机制研究以及基因编辑新方法的开发。综合运用包括化学生物学、表观遗传学、基因编辑、单细胞组学和基因组学等多学科手段，旨在揭示核酸表观遗传修饰的新颖功能和调控机制。
背景介绍
无义突变（Nonsense mutation）是基因序列中编码氨基酸的密码子突变成终止密码子的单碱基突变。无义突变产生提前终止密码子（Premature termination codon，PTC），导致翻译提前终止，产生截短且通常无功能的蛋白质。根据人类基因突变数据库（HGMD；www.HGMD.org），无义突变占据了超过20%的疾病相关单碱基突变。
目前有几种RNA靶向方法来治疗由无义突变引起的遗传疾病。剪接开关反义寡核苷酸可用于剪接序列中含有PTC的外显子，但可能编码无功能或部分功能的蛋白质。小分子已被鉴定可通过口服诱导PTC通读，然而，他们缺乏特异性并且长期使用后显示毒性。工程tRNA已被用于读取PTC，但它们也缺乏序列特异性。利用ADAR和APOBEC蛋白的脱氨活性，开发了几种A-to-I（肌苷）、C-to-U RNA碱基编辑器。例如，dCas13b与ADAR2的催化结构域融合，以实现REPAIR13中的A-to-G替换；ADAR2的定向进化也赋予了它在RESCUE中同时拥有C-to-U编辑的能力。RESTORE和LEAPER利用短gRNA募集内源性ADAR蛋白进行RNA编辑。在人类疾病的小鼠模型中也实现了序列特异性a-to-I编辑。然而，这些RNA编辑工具的脱靶效应仍存在安全隐患。
本文作者首次报道了名为RESTART（RNA Editing to Specific Transcripts for Pseudouridine-mediAted PTC-ReadThrough）的新型RNA单碱基编辑技术。该技术利用改造的guide snoRNA，招募细胞内源的假尿苷合成酶复合物，在RNA特定位点处实现高效、准确地尿苷（U）到假尿苷（Ψ）的编辑。在mRNA的无义突变位点精准引入假尿苷修饰，将PTC转换成ΨAA、ΨAG或ΨGA，以实现PTC的通读及功能蛋白的全长表达。
利用gsnoRNA读取提前终止密码子
作者设计了两个gsnoRNA发夹来靶向mRNA中给定的PTC位点，并在荧光报告蛋白Venus（reporter-1）中插入TAG密码子来提前终止Venus的翻译(图1B)；gsonRNA介导的PTC通读能够诱导Venus蛋白的全场翻译，从而产生荧光(图1C)。为了进一步确定gsnoRNA介导的PTC读取是否依赖于内源性假尿苷合成酶复合物，作者还构建了关键蛋白DKC1的稳定敲低细胞系(DKC1-KD)(图1E)，并且，在DKC1-KD细胞中未观察到gsnoRNAs引起的PTC通读，而gsnoRNAs在正常细胞中明显激活了Venus全长的表达(图1F)，这表明内源性假尿苷合成酶复合物在介导终止密码子通读中发挥了关键作用(图1A)。
图1 使用设计的guide snoRNAs解读过早终止密码子
鉴定和优化gsnoRNA支架以提高RNA编辑效率
为了确定最佳的gsnoRNA支架，除了gACA19外，作者通过RNA二级结构预测软件RNAfold设计了具有稳定二级结构的snoRNA (gACA3、gACA17、gACA2b和gACA36)，并进行了表征(图2A)。其中，gACA36和gACA2b优于gACA19，显示出最高的PTC读取效率 (图2B和2C)。为了研究两个单独的发夹在gsnoRNA中的作用，在5‘或3’发夹中引入突变(图2A)。虽然gsnoRNA的两个发夹靶向同一位点，但编辑效率在很大程度上可能由两个发夹中的一个主导(图2D、2E)。作者将上述gsnoRNA命名为第一代RESTART (RESTARTv1)。
图2 优化gsnoRNA支架来提高PTC的读取效率
DKC1异构体极大地提高了RESTART效率
人类细胞中存在两种DKC1蛋白异构体: DKC1-isoform1含有N端和C端核定位信号(NLS)，该基因的转录本可以选择性剪接得到DKC1-isoform3，该异构体缺乏C端NLS，具有细胞质定位(图3A和3B)。为了测试过表达的DKC1是否会影响RESTART，作者分别构建了DKC1-isoform1和-isoform3的稳定过表达细胞系(图3C和3D)。DKC1-isoform1过表达略微增加了提前终止密码子的读取效率，而在DKC1-isoform3过表达细胞中，荧光报告蛋白阳性细胞相对比例和强度分别增加了2.5倍和5.2倍(图3E-3G)。随着DKC1-isoform3的发现，将gsnoRNA与过表达的DKC1-isoform3的结合称为第二代RESTART (RESTARTv2)。
RESTART对终止密码子的偏好性
既往研究报道了疾病相关PTC的发生频率，UAG、UGA和UAA分别为40.4%、38.5%和21.1%。为了更好地表征RESTART，作者分别构建了包含所有三种类型终止密码子的荧光报告蛋白，并测试了RESTART诱导通读的能力(图3D)。对于UAG密码子，荧光报告蛋白阳性细胞的相对比例和强度分别为28.6%和2.8% (RESTARTv1)以及60.1%和14.7% (RESTARTv2);对于UGA, 荧光报告蛋白阳性细胞和强度的相对比例分别为45.3%和5.8% (RESTARTv1)以及72.3%和28.6% (RESTARTv2)，而UAA密码子在没有外源DKC1的情况下显示出可以忽略不计的信号(RESTARTv1)，在RESTARTv2的情况下显示出2.9%的荧光报告蛋白相对阳性细胞和0.2%的相对强度(图3H, 3I)。增加DKC1-isoform3表达构建体的数量提高了UAA密码子的读通率至14.8%，因此，RESTART介导UGA密码子的通读率最高，其次是UAG，最后是UAA(图3H、3I)。
为了检测RESTART介导的读取确实是由位点定向的假尿嘧啶化引起的，使用基于位点特异性qPCR的方法，所有终止密码子的熔化曲线都发生了变化(图3J)，得出结论，RESTART有效地诱导了细胞内的位点定向假尿嘧啶化。
图3 DKC1-isoform3提高了RESTART的效率
RESTART抑制报告基因中与疾病相关的PTCs
为了研究RESTART是否可以用于纠正疾病相关的无义突变，作者构建了PTC-疾病报告基因 (图4A)。作者设计了基于gACA19和gaca36的gsnoRNA，靶向来自6个致病基因PEX7、SMN1、ALDOB、C8orf37、PCCB和CBS的7个疾病相关无意义突变(图4B)。通过共表达gsnoRNA/PTC疾病基因(RESTARTv1)，能够在所有位点上实现PTC的读取， DKC1-isoform3过表达后，荧光报告蛋白阳性细胞的相对比例比RESTARTv1平均增加到2.8倍(图4C、4D)。Western blotting在转染RESTARTv1和RESTARTv2的细胞中检测到全长ALDOB、SMN1和PEX7(图4E)。结果证明了RESTARTv1和RESTARTv2在人类细胞中不同序列背景下PTC读取中的实用性。
图4 RESTART能够纠正由无意义突变导致的基因紊乱
RESTART的特异性
脱靶编辑可能是基因组工程和RNA编辑的一个重要问题。由于H/ACA盒snoRNP主要催化rRNA和snRNA中Ψ的形成，gsnoRNA或DKC1-isoform3过表达是否会改变细胞RNA中Ψ的丰度。作者使用LC-MS/MS分别定量了总RNA、rRNA、polyA(+) RNA、小RNA和大RNA的Ψ/G比。与gCtrl组相比，gsnoRNA和DKC1-isoform3均未出现显著变化(图5A)。鉴于RESTART不会诱导Ψ水平的全局变化，接下来研究了它是否对RNA转录物亚群具有脱靶活性，作者检测了靶位点的突变/缺失率，证实了RESTART脱靶编辑可能由gsnoRNA的部分碱基配对驱动的假设(图5B)。为了全面评估RESTART的脱靶效应，通过化学合成的CMC衍生物进行了转录组范围的CeU-seq，分别在gACA19 (ALDOB-W148X)和gACA19 (ALDOB-W148X) + DKC1-iso3的mRNA和ncRNA中鉴定出39个和202个脱靶Ψ位点(图5C-5E)。这些位点显示出与靶上序列非常相似的序列基序(图4B和5F)，这与它们依赖于gsnoRNA的观点一致。作者还检测到脱靶基因的RNA和蛋白质水平不受RESTART的影响(图5G-5I)。总之，作者证实了RESTART诱导的脱靶编辑对RNA表达和蛋白质功能没有明显影响，也不会改变mRNA有义密码子的编码信息。
图5 RESTART特异性的表征
RESTART假尿嘧啶可在多种细胞系和人原代细胞中降解内源性转录物
为了研究RESTART是否能够有效编辑内源性转录本，作者设计了11个基于gACA19的gsnoRNA，靶向5个转录本(ACTB、EEF2、PPIB、RPL5和RPS6)的非编码区或编码区的UAA、UAG或UGA。在HEK293T细胞中，RESTARTv1和RESTARTv2均编辑了11个靶向的Us (图6A)，而非靶向的18S rRNA和EEF1A1的假尿嘧啶化状态没有受到干扰(图6B)。随后，作者在原代人真皮成纤维细胞(HDFs)和原代人支气管上皮细胞(HBEs)中测试了RESTART。通过腺相关病毒(AAV)转染，观察到RESTARTv2对内源性转录本的有效编辑(图6C和6D)。接下来，作者进一步使用RESTART实现了内源性CFTR转录本中PTC位点的编辑，显著提高了内源性CFTR蛋白的表达量(图6F)。
图6 RESTAR在细胞系和原代细胞中假尿嘧啶修饰内源性转录物
总结
RESTART技术作为一种可编程的不依赖CRISPR的RNA假尿苷编辑技术，在哺乳动物细胞中实现高效和精确的Ψ修饰，可通过高效编辑mRNA上的无义突变位点介导翻译通读和蛋白功能的恢复，具有较好的安全性，展现了良好的疾病应用前景。
文献信息
Song J, Dong L, Sun H, Luo N, Huang Q, Li K, Shen X, Jiang Z, Lv Z, Peng L, Zhang M, Wang K, Liu K, Hong J, Yi C. CRISPR-free, programmable RNA pseudouridylation to suppress premature termination codons. Mol Cell. 2023 Jan 5;83(1):139-155.e9. doi: 10.1016/j.molcel.2022.11.011. Epub 2022 Dec 14. PMID: 36521489.
