ANGEW丨硫代磷酸化DNA工程脂质体作为刺激响应细胞特异性递送和基因组编辑的通用平台

大家好，给大家分享一篇近期发表在《Angewandte Chemie International Edition德国应用化学》上的一篇文献，题目是Phosphorothioated DNA Engineered Liposomes as a General Platform for Stimuli-Responsive Cell-Specific Intracellular Delivery and Genome Editing硫代磷酸化DNA工程脂质体作为刺激响应细胞特异性递送和基因组编辑的通用平台。通讯作者是来自华东师范大学的李迪教授。

细胞内蛋白质递送对于基于蛋白质药物的细胞治疗是非常关键的。但是受于细胞特异性和胞质递送蛋白效率差的问题，阻碍了对特定细胞群的靶向治疗。融合脂质体系统可实现胞质递送，但其细胞特异性和可控性递送能力是相当有限的。作者从研究病毒融合的动力学中受到启发，设计了一种硫代修饰的DNA涂层融合脂质体模拟病毒血凝素的功能。将载货脂质体停靠在靶细胞的膜上，在pH或紫外线刺激下触发膜融合，并促进细胞内蛋白的递送。结果表明，脂质体上的硫代磷酸DNA插件单元可以有效地靶向递送不同大小和电荷的蛋白质，这表明在体外和体内，硫代磷酸DNA插件单元是一种时空可控的蛋白质递送策略。

病毒可能是最有效的原生递送系统。被包膜的病毒首先进入宿主细胞与受体结合，然后发生构象变化最终通过膜融合传递生物大分子。病毒融合蛋白如甲型流感病毒通过刺突蛋白血凝素(HA)进入宿主细胞。HA包含两个亚单位:受体识别和PH反应结构域HA1和膜融合结构域HA2，内体的弱酸性环境导致HA1的解离和HA2的暴露，启动与宿主细胞的融合过程。VLPs封装货物蛋白，保护抗降解，识别靶细胞，启动融合，并释放货物蛋白到细胞质中但其存在免疫原性高、制作复杂、患者接受度低等问题，严重限制了其临床应用潜力。

本文计了一种模拟血凝素的DNA融合蛋白载体(HACKER)系统，以实现刺激响应靶向细胞内蛋白递送。引入了硫代磷酸(PS) DNA形成动态二硫键交换促进快速膜融合。该系统可以通过胆固醇很容易地插入传统脂质体，辅助pH或UV光激活融合，且具有高度的时空可控性。细胞特异性蛋白递送可以通过简单地定制核酸适体实现;通过使用这个HACKER系统，证明了该系统的细胞内的高效递送与广泛的生物活性分子的功能，包括蛋白质、小分子药物、核酸和纳米材料。最后研究人员展示了一项成功的基于这个系统递送cas9的基因组编辑功能。

HACKER系统发生构象变化并触发膜融合

受血凝素HA刺激响应构象变化的启发，本文设计了一个融合系统(HACKER)硫代磷酸(PS) DNA，其中DNA磷酸骨架中的非桥接氧被硫取代(图1b)。简而言之，HACKER系统是一个PS DNA双链通过三个杂交形成 (图1c)。链1是33/40 nt PS DNA(分别针对UV光或PH响应)，在3 '端有胆固醇修饰。链2是16 nt的PS DNA，与1部分互补并在5 '端有胆固醇修饰。链3由两个功能区段组成，(i) PEG maskant (PEG-5000)和(ii)刺激响应性与之磷酸(PO) DNA片段链 1号的另一部分互补。刺激反应节点(ii)可以是光切割连接器(PC连接器) (图1c，顶部)，或响应于pH的i-motif(图1c，底部)。杂交后，DNA双链是通过胆固醇插入到脂质体上。在此外，还制备了具有HACKER系统的脂质体细胞适配体(apt-HACKER-Lipo)也可通过胆固醇插入来模拟HA1对靶细胞系的识别功能(图1d)。配备apt-HACKER单元的脂质体和靶细胞孵育。在通过适配体对靶细胞识别，PEG maskant阻断PS DNA与细胞膜的接触，然后UV光处理或将pH降至6.5时，PC接头发生裂解(图1c), 或i-motif的形成(图1c，底部)，去除PEG maskant和暴露1和2链。最近的研究表明PS DNA通过动态的巯基交换能更高效地进入哺乳动物细胞膜。在去除PEG maskant后， PS DNA的暴露可以拖脂质体接近细胞膜进入促进膜融合和货物释放(图1d)。

图1. 血凝素介导的膜融合机制及HACKER的设计

验证PS DNA介导融合

由PS组成的融合系统DNA(链1和链2)装配脂质体(PS DNA- lipo)和Hep G2细胞膜源性囊泡(CM囊泡)建立融合交换。用荧光回收测定(图2a)如图2b，荧光仅在CM囊泡和PS DNA-Lipo混合物中观察到恢复。利用荧光共振能量转移(FRET)验证NBD-PE和罗丹明- PE制备的PS DNA-Lipo用于脂质交换实验。融合后，FRET效率减弱NBD和罗丹明之间的距离增加(图2c)，表明与CM的有效脂质融合交换。同样，FRET仅在CM囊泡和PS DNA-Lipo混合系统细胞中受到极大抑制(图2d)。融合诱导的脂质体大小变化为通过动态光散射(DLS)测量进一步证实。CM囊泡和PS的平均直径DNA-Lipo混合物从67.9 nm增加到82.2 nm(图2 e)。

图2. PS DNA通过与膜蛋白的动态巯基交换介导膜融

随后抑制剂实验证实硫醇交换诱导的融合机制。CM囊泡用 DTNB和DTT抑制PS DNA，表明PS DNA促进通过形成二硫键实现膜融合结合。而另一种抑制剂DTT没有阻碍融合，我们推测DTT使二硫键还原将膜蛋白转化为巯基，进一步提高形成动态二巯基网络，因此无法抑制与PS DNA的融合（图2 f）。

通过脂质体与活细胞膜融合的PS dna介导的蛋白质递送

在确认PS DNA- lipo与CM囊泡之间的有效融合交换后，进而研究了PS DNA介导的蛋白质递送到活细胞效率。选择异硫氰酸罗丹明B (RBITC)标记的细胞色素C (Cyt C)作为模型蛋白货物。孵育30 min后，Hep G2细胞中几乎看不到RBITC的红色荧光。1、5组Hep G2细胞中几乎看不到RBITC的红色荧光，但均匀分布在细胞膜上第2 ~ 4组在细胞质中均有表达。PS DNA-Lipo(组4)保持最高的递送效率。通过内吞抑制实验表明PS DNA诱导的胞质蛋白递送到活细胞也主要归因于巯基交换介导的膜融合（图3 c）。HACKER系统相对于病毒来说具有较低的细胞毒性，通过递送BSA具有解毒功能，这里验证了其在Jurkat细胞和原代CD8+ T细胞较高的递送效率和较低的细胞毒性（图3 d）。

图3. PS DNA膜融合介导的细胞内蛋白递送

在确认PS DNA介导的融合后，引入pH和UV刺激来启动胞质蛋白递送。用4种不同的蛋白质验证了这一特性，四种蛋白货物大小和等电点(pI)不同。与Hep G2细胞共同孵育。细胞/脂质体混合，然后允许光照射5 min至裂解PC连接子(图4a)或降低培养基pH到6.5，诱导i-motif构象变化(图4b)，释放PEG maskant。经过紫外线或pH刺激后，增强的荧光证实递送蛋白的量显著增加(图4c-f)。这种通用的货运平台具有广阔的应用前景并且系统最大限度地保留了货物的活性。

图4. HACKER系统对生物活性蛋白的刺激响应性递送

研究人员进一步用细胞适配子将HACKER系统功能化(apt-HACKER)实现细胞特异性递送。简单地说,一个将胆固醇结合的细胞适配子MUC-1组装在载有HACKER蛋白的脂质体上系统(protein@apt-HACKER-Lipo)。然后将apt-HACKER-Lipo与细胞混合物孵育包含目标细胞和干扰细胞。识别适配体的作用导致脂质体与靶细胞特异结合，和干扰细胞结合较弱，经过洗脱洗去未结合的脂质体。刺激之后，停靠的脂质体仅与靶细胞实现融合和目标货物释放(图5a)。细胞实验和斑马鱼体内实验表明apt-HACKER在特异性和提高效率方面的巨大潜力。

图5 apt-HACKER-Lipo实现了刺激应答性和细胞特异性靶向蛋白递送

HACKER系统辅助的Cas9 RNP递送和基因组编辑

图6 HACKER系统辅助的基因组编辑

作者还研究了HACKER系统用于递送基因组编辑系统工具的潜力。CRISPR-Cas9系统被广泛应用特异性基因突变。然而，递送Cas9蛋白和 sgRNA载体仍是研究的热点。将PH敏感的HACKER修饰的脂质体(Cas9 RNP-pH-HACKER-Lipo)中装载Cas9蛋白sgRNA。使用具有稳定增强型绿色的HeLa细胞以荧光蛋白(EGFP)表达为模型进行验证HACKER辅助的EGFP基因破坏(图6a)。Cas9 RNP-HACKER-Lipo首先孵育EGFP-HeLa细胞。一种商业RNP CRISPRMAX (CMAX)作为阳性对照。如图6b所示，pH刺激后，绿色荧光EGFP的表达明显减少。流式细胞术分析表明，EGFP基因在约经PH-HACKER介导后，60%的细胞荧光减弱 (图6c)。通过T7核酸内切酶I (T7E1)酶切试验检测进一步分析EGFP基因突变效率为(图6 d)。HACKER介导的基因组编辑EGFP基因座在HeLa细胞中引起插入缺失频率增加(插入和删除)高达21.2%，更高高于CMAX(6.9%)。

总结

1构建了磷酸化DNA涂层脂质体来模拟病毒血凝素的功能

2在pH值或光触发，并促进蛋白质的细胞递送

3该系统能够递送不同大小和电荷的蛋白质，高效细胞靶向，时空可控