Nat Commun丨将核酸适体转化为分子开关的大规模并行筛选平台
今天分享的文献是2023年4月发表在nature communications的文章，题目是A massively parallel screening platform for converting aptamers into molecular switches。通讯作者是来自斯坦福大学的H. Tom Soh教授，H. Tom Soh教授课题组的研究方向主要包括：功能分子的体外定向进化；生物传感器和集成的分子诊断；基于微流体的生物分离和细胞分选技术。
研究背景
基于核酸适体的分子开关具有结合诱导的构象变化，已被证明具有广泛的应用价值，例如细胞中的代谢物成像、靶向药物递送和生物分子的实时检测。由于传统的核酸适体筛选方法通常不会产生具有固有结构切换功能的适配体，因此必须在筛选过程中将核酸适体转化为分子开关。设计此类适体开关的工作通常使用基于计算机二级结构预测的理性设计方法。然而，现有软件无法准确模拟三维寡核苷酸结构或非规范碱基配对，限制了识别合适的序列元件进行靶向修饰的能力。本文报道了一种基于大规模并行筛选的策略，该策略可以将几乎任何核酸适体转化为分子开关，而无需事先了解适体的三维结构。
结果与讨论
1. 核酸适体开关域的高通量筛选策略
如图1a所示，在该筛选策略中，核酸适体和置换链通过碱基配对耦合在一起，形成ADS（anchored displacement strand, ADS）结构。“适体链”由已知的感兴趣核酸适体序列组成，在其5 '端标记有荧光猝灭基团，在其3 '端标记有锚定序列。“开关链”是筛选过程的可变部分，负责赋予结构体经历靶标结合诱导的构象变化，从而导致荧光信号的变化。“开关链”包括一个与适体链的锚定序列互补的序列、一个聚T连接子和一个随机的10个核苷酸开关结构域（SD）序列组成，并在其3 '端进行荧光标记。
在开关兼容的ADS结构中，两条链的互补锚定区域是杂交的，并且在没有靶标的情况下，SD序列也与适配体序列相互作用。SD序列通过25核苷酸poly-T接头连接到锚链上，在没有延长的腺苷碱基的情况下，该接头与其他DNA链的相互作用最小。本文中，经优化后的ADS构建体，靶标结合会导致核酸适体链发生构象变化，从而改变荧光团和淬灭剂之间的平均距离，进而导致荧光信号改变（图1b）。这一设计的优势在于可在单次分析中筛选几乎所有可能的N10 SD序列（~ 100万个），从而绕过了耗时且昂贵的结构分析、序列设计和优化过程。
整个ADS筛选过程在MiSeq高通量测序仪的flow-cell上进行，包括三个步骤：1）开关链库的测序；2）ADS适体结构的组装； 3）靶标响应适体开关的鉴定（图1c）。该方法能够直接将每个开关链序列的基因型与产生的ADS结构的功能表型（即开关行为）联系起来。在第一步中，使用标准Illumina测序协议在MiSeq上对具有可变N10 SD区域的开关链文库进行测序。然后在flow-cell上组装ADS结构体。通过将淬灭剂标记的核酸适体链退火到开关链簇上，完成组装ADS结构体。在筛选过程的第三步和最后一步中，用缓冲液洗涤flow-cell并进行荧光成像。然后将目标分子注射到flow-cell，并拍摄另一张荧光图像。通过比较这两幅图像的荧光强度，可以识别出ADS结构体经历了靶标诱导的荧光信号变化，无论是信号开启还是信号关闭。最后用50 mM NaOH洗涤流动池，从ADS文库簇中去除靶分子和适体序列，然后重新退火适体链，以进行重复测量。
图1. ADS构建体概述以及用于将已知核酸适体转化为分子开关的高通量筛选过程。
2. ATP响应性ADS构建体的筛选
作为ADS筛选平台的初始测试，作者们首先使用了一个经过充分研究的DNA适体，该适体结合ATP的解离常数（KD）为6 μM。该适体已被广泛研究，与大多数DNA适体不同，它的三维结构已通过核磁共振得到解析，从而能够更好地评估筛选的开关链与亲本适体本身之间相互作用的性质。为了研究ATP适体的特定区域是否优先与这些开关中的SD区域相互作用，作者们创建了一个直方图，表示在前1000个ADS开关候选序列中，ATP适体的每个碱基位置最终被SD序列识别的频率（图2a）。在ATP适体序列中观察到两个清晰的峰，它们是SD序列碱基优先配对的目标。令人惊讶的是，序列比对分析显示，许多这些SD区域与适体的互补性极小（图2b）。事实上，在前1000个SD区域中，超过10%的区域与适体的反向补体的Smith-Waterman相似性得分为3或更低，这意味着SD中的10个碱基中只有3个将被预测与ATP适体杂交。这一结果表明，许多开关结构必须依赖于广泛的错配碱基配对或非规范的核酸相互作用，这与先前的发现一致，即自然进化的核糖开关也广泛利用这种非规范的相互作用。
图2. 前1000个表现最佳的ADS序列分析。
通过使用MEME中的motif发现工具分析表现最佳的序列，确定了ATP适体中被开关结构域优先靶向的两个区域对应于不同的重复序列motif。其中，三个序列motif （m1, m2和m3）与开关函数具有统计学显著相关性。在前1000个序列中，motif m1、m2和m3分别占28.2%、9.3%和4.9%。所有这三个都与ATP适配体的不同区域互补（图2c），并与图2a中确定的两个直方图峰之一重叠。通过分析NMR测定的ATP适配体的二级结构，发现m2基序与ATP结合袋之一（核苷酸17-20）互补，而m3基序识别适配体茎的5 '端（核苷酸1-5），两者都代表了可以用合理设计的SD靶向的区域。有趣的是，m2基序在SD序列中包含一个不匹配的碱基，这表明不完全互补的位移链可能在某些开关结构中产生最佳性能。因为不匹配可以很好地调整杂交反应的热力学。
然而，合理设计的位移链通常不包含不匹配碱基，因此这种方法可能会忽略这部分序列。此外，令人惊讶的是m1基序（核苷酸13-17）出现在超过四分之一的前1000个SD序列中。这表明m1识别的短DNA环可能是开发位移链开关的特别响应目标。传统观点认为这种链应设计为针对稳定适配体结构的结合口袋或茎，以确保适配体在不首先与位移链解耦的情况下无法结合目标。这些结果突出了通过采用更广泛和更不可知的方法来识别赋予最佳开关特性的位移链可以得出的价值，而不是依赖于关于结构函数关系的潜在误导性先验假设。
图3. ATP核酸适体开关的鉴定和表征。
3. ATP适体开关的实验验证
为了验证适体开关的功能，作者们选择了8个单独的ADS结构进行表征和进一步分析。在ADS筛选过程中，当与ATP结合时，所有8个序列的荧光强度都增加了6~8倍，表明具有强大的信号开启响应（图3a）。由于屏幕依赖于MiSeq软件从原始图像中自动提取的簇强度值，因此作者们通过使用自定义Python脚本手动检查flow cell中的原始簇图像（代表性簇图像如图3b所示）进一步验证了这些荧光信号的产生是真阳性响应。
图4. 前1000个表现最佳的葡萄糖适体开关SD序列分析。
由于MiSeq测序硬件对4种测序荧光图像信号收集处理不一定是为定量荧光强度测量设计的。因此，作者们进一步使用酶标仪测定来验证和表征适配体开关的活性。通过化学合成选定的开关链，并通过以1：1的比例退火开关链和适配体链来组装荧光团和淬灭修饰的ADS构建体。然后，用不同浓度的ATP滴定后，在酶标仪上测量了固定浓度（50nM）下这些ADS构建体的靶标诱导荧光响应（图3c）。每种构建体都显示出剂量依赖性荧光增加，与高通量筛选的结果一致。通过拟合双结合位点模型来确定它们的KD，该模型先前用于表征由相同适配体开发的ISD结构。在含有随机开关结构域的5种对照ADS构建体（atp1-s1、atp1-s2、atp2-s1、atp4-s1和atp6-s1）中，荧光信号没有剂量依赖性变化，表明开关结构域的特定序列是成功实现结合诱导开关的必要条件。
通过拟合计算得到8组ADS结构的KD值在12 ~ 157 μM之间，而原始ATP适配体的KD值为6 μM。尽管ADS构建体的动力学比亲本适体稍慢，但这种结合动力学的微小减少对大多数适体开关的应用没有显著影响。
4. 葡萄糖响应的碱基修饰DNA适体开关
接下来，作者们探索了该方法是否可以推广到含有非天然的、化学修饰的核酸适体序列，以鉴定对葡萄糖敏感的高亲和力适体开关。像葡萄糖这样的小分子靶标已经被证明是对天然DNA和RNA适配体具有挑战的靶标，部分原因是它们作为识别位点提供的化学官能团数量有限。先前的研究表明包含化学修饰的核碱基的适体可以与这些具有挑战性的目标实现强大的结合，因此作者们开始筛选这种适体作为葡萄糖反应开关的基础。
作者们首先采用之前发表的click-PD筛选方法获得硼酸修饰的适体（命名为NNG），该适体对葡萄糖具有高亲和力。利用二级结构分析来指导NNG的截短，结果显示，NNG的一级结构元件是位于序列3 ' 端附近的一个最小的30个核苷酸发夹（该区域可能是适体的结合位点），整个序列中只有8个碱基被修饰（图4a）。NNG的KD值为1.9 mM，大约比最好的天然DNA适体对葡萄糖的亲和力高一个数量级，与全长序列相比，截短的NNG（NNGmin）对葡萄糖的亲和力进一步增加。这些结果表明，NNGmin序列将适合于开发葡萄糖响应开关。
为了深入了解适配体中哪些碱基是开关功能的关键，作者们随后对前1000个SD序列进行了MEME分析，以确定任何保守的基序。结果显示，15.7%的最佳序列绝大多数靶向glu1min的5 '端附近的2-5个碱基（图4a）。葡萄糖适配体中每个碱基位置与其中一个表现最好的SD序列互补的频率直方图也显示在5 '端有一个显著的峰值，与MEME分析一致（图4b）。
与ATP 的ADS结构一样，序列比对分析显示，SD序列与非天然葡萄糖适体的互补性明显较低。在排名前1000的序列中，约73%的序列对适体的反向补体的Smith-Waterman得分≤4（图4c），这表明在表现最好的SD序列中，超过一半的碱基不会通过典型的Watson-Crick碱基配对与适体相互作用。作者们推测可能的原因是由于碱基修饰的不稳定效应，硼酸修饰在碱基5-8和9-12上的分组可能有助于低SD互补性，这导致了替代相互作用，无法用现有工具预测或建模。因此，这一结果再次表明，许多性能最好的SD序列在很大程度上是由参与非规范结合模式的碱基组成的，这些模式在基于理性设计的尝试中很可能无法识别。
图5. 苯硼酸修饰的葡萄糖适体开关的鉴定和表征。
最后，作者们鉴定并实验验证了四种基于NNGmin的开关结构，它们对葡萄糖具有低亲和力。作者们选择了四个开关（giu1-4），在靶标存在的情况下表现出最大的信号关闭响应（减少1.3 - 2倍），通过聚类图像分析（图5a，b）也验证了这一点。然后，在酶标仪中评估了这四个开关序列对葡萄糖亲和力。如上所述的ATP筛选一样，所有四个序列都显示出预期的剂量依赖性荧光下降，最大信号变化约为flow cell中观察到的两倍。所有四种ADS构建体都具有约0.3 mM的亲和力，这些构建体对葡萄糖的敏感性比先前发表的基于天然DNA的开关高30倍（图5c）。
传统上，将核酸适体转换为基于链位移的开关会导致表观KD增加，因此需要更高的靶标浓度来竞争互补链。本文报道的筛选方法鉴定的非规范相互作用在保留其亲本适体亲和力的ADS开关结构中具有显著优势，且碱基修饰的DNA可用于开发具有挑战性的小分子靶标的高亲和力开关。
总结
本文报道了一种基于大规模并行筛选的策略，该策略可以将几乎任何核酸适体转化为分子开关，而无需事先了解适体结构。使用该方法，作者从先前发表的ATP适体和新筛选的硼酸修饰的核酸适体产生多个分子开关，它们分别通过二级动力学结合其分子靶标进行信号开启和信号关闭。该葡萄糖响应开关的灵敏度比先前报道的基于天然DNA的开关高30倍左右。该方法提供了一种通用的策略，用于从广泛的适体中生产目标特定的开关。
