NAT BIOTECH丨 ARPLA实现细胞中糖基化RNA原位成像
大家好,今天为大家分享的文献是2023年5月发表于Nature biotechnology上的“Spatial imaging of glycoRNA in single cells with ARPLA”。
作者介绍:
本文的通讯作者是来自于德克萨斯大学奥斯汀分校的陆艺教授。陆艺教授课题组的研究方向主要包括:1)金属酶结构和功能模拟物的合成及其在可再生能源生成和小分子活化中的生物催化剂应用;2)体外筛选 DNAzymes/aptamers并开发高灵敏高选择性的金属离子和小分子传感器,用于环境监测、食品安全及疾病诊断;3)DNA纳米材料的编码合成和定向组装用于疾病早期诊断和靶向药物递送。
背景介绍:
细胞中的聚糖通过调节细胞通讯、体内平衡、免疫和胚胎发生等多种过程,在生物学中发挥着重要作用。蛋白聚糖、糖蛋白和鞘糖脂已被广泛研究,但糖基化的RNA(glycoRNAs)在2021年才被斯坦福大学的Carolyn Bertozzi教授团队和哈佛大学的Ryan Flynn教授团队发现。glycoRNAs上修饰有含唾液酸的聚糖分子,能够与免疫球蛋白样凝集素(siglec)相互作用,显示出其可能的重要生理功能。然而,由于缺乏有效且特异性的成像技术,使得对glycoRNAs的研究受到了限制,其在细胞内的分布、生理作用以及与疾病的相关性等尚未明确。
针对以上问题,本文开发了一种名为ARPLA(唾液酸适配体和RNA原位杂交介导的邻位连接技术)的glycoRNAs原位成像方法,这种方法首次实现了细胞内glycoRNAs的原位观测,并具有极高的灵敏度和特异性。
结果介绍:
- 开发ARPLA用于glycoRNAs的原位成像
作者设计的ARPLA包括四部分:1)特异性结合glycoRNAs中高丰度唾液酸的核酸适体,并延伸出Spacer和Linker G序列,用于减少空间位阻和作为连接反应的模板(Glycan probe);2)带有Spacer和Linker R序列的特定RNA原位杂交DNA探针(RNA-binding probe);3)原位邻近连接反应探针(Connector 1/2);4)修饰有荧光基团的单链DNA报告探针(Reporter)。
为了验证 ARPLA,作者使用激光共聚焦扫描显微镜检测了Hela细胞中的小核RNA U1。可以看到 HeLa细胞的质膜上有很强的ARPLA信号,而当没有核酸适体、FISH探针或者Connectors时,信号急剧减弱,证明了这些元件的必要性。同时,将唾液酸的核酸适体换成一段随意的DNA序列后信号也大大降低,证明了核酸适体在识别聚糖中的关键作用。
为了确定ARPLA能否半定量检测glycoRNAs,作者用RNase A和RNase T1分别处理细胞,发现信号均极大减弱,说明细胞表面的RNA是产生信号的先决条件。随后,作者用糖基化抑制剂处理细胞,发现信号也明显减弱,说明了该方法检测聚糖的特异性。
用ARPLA可视化glycoRNAs的空间分布
已有文章报道glycoRNAs存在于质膜上,但其详细的空间分布尚不清楚。脂筏是细胞膜上有序且紧密排列的微结构域,是许多信号受体锚定的关键位置,因此,作者研究了glycoRNAs与脂筏的空间位置关系。通过ARPLA成像glycoRNAs,AF555修饰的CT-B或BODIPY染料标记脂筏,发现glycoRNAs与脂筏共定位。
接下来,作者用ARPLA探究了glycoRNAs的细胞内运输机制。可溶性N-乙酰亚胺敏感因子连接的蛋白质受体(SNARE)在细胞膜融合及囊泡对接中具有重要作用,因此,glycoRNAs的运输过程可能与SNARE相关。为了验证这一假设,作者使用ARPLA对膜渗透后的细胞内glycoRNAs进行成像,并用抗体染色SNARE,发现glycoRNAs定位于SNARE蛋白包裹的脂质囊泡中,表明glycoRNAs通过SNARE介导的膜融合转运至细胞表面。
- 在乳腺癌中可视化glycoRNAs
为了探索glycoRNAs与疾病的潜在关联,作者探究了健康乳腺细胞和乳腺癌细胞中glycoRNAs的丰度差异。作者选用了非致瘤性(MCF-10A)、恶性(MCF-7)和转移性(MDA-MB-231)乳腺癌细胞系作为模型,发现MCF-10A细胞的荧光信号最强,MCF-7细胞次之,MDA-MB-231细胞信号最弱,表明细胞表面glycoRNAs的丰度与肿瘤的恶性和转移呈负相关。
- 免疫细胞分化和免疫反应中glycoRNAs的变化
虽然先前的研究表明,膜相关的细胞外RNAs在单核细胞活动中发挥功能,但glycoRNAs在免疫细胞分化及免疫反应中所发挥的作用未知。故作者探究了THP-1单核细胞分化为M0巨噬细胞过程中glycoRNAs的变化,发现M0巨噬细胞中U1、U35a 和Y5 的glycoRNAs 信号相比于THP-1细胞有所降低。
为了更深入地了解glycoRNAs在先天免疫中的作用,作者评估了致病刺激后glycoRNAs的变化,发现活化的M0巨噬细胞,在大肠杆菌来源的脂多糖(LPS)刺激下,U1、U35a和Y5的glycoRNAs信号增加。这些结果表明,glycoRNAs在免疫细胞分化和激活过程中发生了显著变化,暗示了它们在先天免疫应答中的潜在作用。
单核细胞-血管内皮细胞(M-EC)相互作用是炎症反应中的一个重要事件,对单核细胞从血液向炎症组织的迁移至关重要,而这一过程受到糖蛋白的高度调控。受免疫细胞分化和激活过程中glycoRNAs水平变化的启发,作者推测glycoRNAs可能参与炎症反应。为了验证这一推测,作者采用M-EC粘附实验,比较RNase处理前后免疫细胞的粘附能力,用于探索glycoRNAs在M-EC相互作用中发挥的功能。结果显示,RNase处理降低了THP-1、M0巨噬细胞以及LPS刺激后的M0巨噬细胞的粘附能力。此外,RNase处理还减弱了HL-60和dHL-60细胞的粘附能力。这些结果表明,glycoRNAs的去除与免疫细胞对ECs附着的衰减有关,提示glycoRNAs可能在炎症过程中介导M-EC相互作用。
总结与讨论:
本文开发了ARPLA方法,无需代谢标记预处理,即可实现各种类型样品中glycoRNAs的高灵敏度和高特异性原位成像。此外,通过简单地改变RNA识别序列,ARPLA即可实现几乎任何glycoRNAs的原位检测。但该方法也存在一些不足之处,如可使用超分辨成像技术结合荧光共振能量转移,确定每个细胞glycoRNAs的拷贝数等;同时,由于该方法需要设计DNA序列与glycoRNAs进行特异性杂交,所以无法检测未知序列的糖基化。
文章链接:
https://doi.org/10.1038/s41587-023-01801-z