JACS | 一种克服天然过氧化物酶局限性的多肽-核酸嵌合生物催化剂
今天分享的是发表在J. Am. Chem. Soc.上的一篇文章，标题为Chimeric Biocatalyst Combining Peptidic and Nucleic Acid Components Overcomes the Performance and Limitations of the Native Horseradish Peroxidase.
该文的通讯作者为南京大学的周俊教授，该课题组的主要研究方向包括特殊DNA结构，G-四链体结构的设计，性质及其在催化和生物分析。
研究背景：
目前通过设计不同的策略，如定向进化或酶固定化来克服天然酶的缺陷，虽然高效，但本质上是脆弱的。为了克服这一局限性，提出了设计“人工酶”的策略，以获得具有更高催化活性或全新反应性的人工酶。近年来，随着对天然酶催化机制有了更深入的了解，人工酶的开发取得了重要进展。一个典型的例子是基于对酶活性位点结构的解析设计新型的模拟辣根过氧化物酶（HRP）人工催化剂。它是一种由特殊G-四链体结构与HRP的辅因子血红素（Hemin）组成的脱氧核酶（DNAzyme）。此外，通过重建和优化血红素-铁催化中心以及自组装多肽为血红素提供结合位点以促进体系的催化活性，突出了DNA和/或肽模块化设计人工酶系统的潜力。长期的探索已经构建了许多人工催化剂，但是依靠单一催化位点其催化活性实际上无法与天然酶相比。
作者通过将DNA、多肽和酶辅因子共价组装在单一支架中，设计了一种新型嵌合多肽-脱氧核酶（Chimeric peptide-DNAzyme，CPDzyme），通过精确调控构建块的排布获得了一种性能优异的人工过氧化物酶（图1）。
图1. 本文设计的CPDzymes
结果与讨论：
1. CPDzymes的制备
作者首先采用两个羧基修饰的不对称Hemin和链霉亲和素包裹的磁珠（MB-STV）合成策略。通过生物素-链霉亲和素技术在MB-STV连接化学修饰的DNA链（其中 5’端修饰生物素，3’端修饰氨基，以及光控linker（PC linker）和G四链体形成序列）；之后两端带有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）修饰的Hemin分别与DNA链和多肽或者氨基酸偶联；最后紫外照射，PCLink裂解，在K+存在下，CPDzyme释放（图2a）。CPDzyme的结构如图2b所示，血红素的一个羧基臂（绿色）共价与折叠的G-四链体结构偶联（灰色）；另一端与氨基酸偶联（蓝色）。
之后，作者利用2,2-偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）和存在H2O2时的氧化反应模型评估了CPDzyme的催化活性。结果表明，G-四链体和Hemin共价连接（G4-Hemin）时，其催化活性是G4/Hemin非共价组装的8.8倍。 此外，作者筛选了连接的氨基酸，结果表明，带负电的氨基酸（Asp，D）略微降低了其催化活性；中性氨基酸（Val，V；Phe，F和Asn，N）对体系的催化活性没有影响；而带正电的氨基酸（Arg，R 和His，H）显著提高了催化活性，分别提高了2.5倍和3.2倍（图2c）。上述结果表明，G-四链体、血红素和多肽之间通过共价连接使体系催化活性更高，且当连接的氨基酸为带正电的His或Arg时催化活性最高。
图2. CPDzyme的合成示意图和所连接氨基酸的筛选
2. CPDzyme中嵌入赖氨酸提高其催化活性
已有相关报道证实，HRP中远端His必须定位在离催化中心最佳的距离上才发挥其作用。因此，作者借助赖氨酸（Lys，K）作为桥接增加Arg/His与hemin之间的距离，促进嵌合催化剂中氨基酸的正确取向。结果表明，在CPDzyme中嵌入Lys其催化活性提高了2倍（图3a），其中G4-Hemin-KH活性最高。这是由于Lys的嵌入使His发挥天然酶中的作用，能够与血红素铁原子正上方的H2O2配位，促进反应中间体的生成（图3b）。
图3. 在CPDzyme支架中嵌入赖氨酸提高其催化活性
3. CPDzyme仿生协同催化设计
作者通过嵌入更多的带正电的His和Arg提高CPDzyme的催化活性。结果表明，同时嵌入两个His并没有提高CPDzyme的催化能力；而协同嵌入His和Arg其催化能力最高，即G4-Hemin-KHR（图4a，V0= 432±15 nM/s）。之前研究证实，在天然酶中Arg的突变会导致催化活性丧失，从定向角度突出了Arg的重要作用。图4b中展示了天然过氧化物酶中常见的结构Hemin-KHR，证明His和Arg同时存在并且在空间上精确排布，能够以协同相互作用提供CPDzyme的催化效率。
借助天然过氧化物酶结构，作者发现除了上述氨基酸，天冬酰胺（Asn，N）、苯丙氨酸（Phe，F）和色氨酸（Trp，W）的引入也可能进一步提升CPDzyme的催化活。结果表明，Asn需要精确位置与His形成氢键，才能够提升体系的催化活性；Phe的引入不影响CPDzyme的催化活性 ；而Trp的引入提升CPDzyme的催化活性（图4c-f），是因为Trp参与氢键的形成和催化过程。上述结果表明，Trp的引入使CPDzyme具有最佳的催化性能，最佳的组合为：G4-Hemin-KRHW，其中Arg和Trp分别在His两侧（V0= 574±15 nM/s）。
图4. CPDzyme的仿生及协同催化设计
4. CPDzyme的人工协同催化设计、催化机制与动力学
His一方面与H2O2形成氢键，另一方面作为酸碱催化剂，成为催化过程中的关键氨基酸。为此，作者以G4-Hemin-KHR为支架，尝试通过引入更多的His提高CPDzyme的催化活性。结果表明，引入更多的His并没有增加催化活性，而引入更多的Arg催化活性增加1.5倍（V0从432±22 增加到623±29 nM/s）。作者认为His数量增加没有提升催化活性，可能是因为缺乏Arg辅助催化新加入的His；Arg数量的增加能够进一步形成和稳定复合物Ⅰ，即G4-Hemin-KHR + 2R的V0达到600 nM/s。上述结果表明，H2O2是HRP活性的核心，H2O2必须位于催化位点附近，His和Arg辅助其定位在hemin附近。作者进步探究了两个His和两个Arg对CPDzyme催化活性的影响，结果表明，具有两个His/Arg组合体系的催化活性比一个His/Arg组合体系的催化活性高2倍左右（图4d）。当体系中的两个His被Arg隔开时，催化活性会更高（HRHR, RHRH, HRRH > HHRR, RRHH, RHHR），其中G4-Hemin-KHRRH 催化活性明显高于G4-Hemin-KRHW (V0 = 574 ± 15 nM/s)，提高到了1009 ± 30 nM/s。鉴于上述结果，作者提出了G4-Hemin-KHRRH的催化机制：两个H2O2分别被两个His/Arg对捕获，之后传递给血红素，为血红素提供了一个“双燃料”体系，从而大大提高了整个体系的催化速度和效率（图5e）。
为了更深入地了解CPDzyme催化反应的方式，特别是与天然HRP作比较。作者计算了每一轮优化后各个体系Michaelis-Menten曲线的稳态动力学。结果表明，G4-Hemin的kcat（32 s−1）优于非共价连接的G4/Hemin (0.3 s−1)；同样地，G4-Hemin-H的kcat为95 s−1，也优于非共价连接的 G4/Hemin-H。引入Lys作为间隔基团，G4-Hemin-KH的kcat达到259 s−1，证实了精确空间排列的重要作用。His和Arg的协同引入使G4-Hemin-KHR的kcat增加到381 s−1，证实了HR对的协同作用。进一步引入其他的氨基酸，使CPDzyme催化活性接近HRP（G4-Hemin-KRHW的kcat为436 s−1）。最后，筛选优化的G4-Hemin-KHRRH的kcat达到784 s−1，这比HRP高1.5倍，比非共价G4/Hemin高2600倍。上述结果表明：在单个支架中共价连接的G-四链体、血红素和多肽可以达到协同催化的作用。此外，G4-Hemin-KHRRH的其他参数（Km和kcat/Km）也证实了其优异的催化性能。Km值从G4-Hemin-H的194 mM下降为127 mM，表示其亲和力的提升；而kcat/KM值也从G4-Hemin-H的0.49 s-1 mM-1升高到6.17 s-1 mM-1，表示其催化效率的提升。
作者评估了G4-Hemin-KHRRH CPDzyme在广泛的非生理条件下的催化性能，如有机溶剂，95℃的高温和广泛的pH值（从2到10）条件下。结果表明在非生理条件下CPDzyme依旧保持高度催化活性，而HRP则没有（表1），突破了HRP的局限性。
图5. CPDzyme人工协同催化设计，催化机制和动力学
表1 不同催化剂在不同条件下对染料的降解率
图6. 多轮人工优化后的CPDzyme催化速率超过天然HRP
总结：
作者通过四轮优化获得了速率相较于天然HRP高1.5倍的G4-Hemin-KHRRH CPDzyme，相比与非共价G4/Hemin催化活性有提升了2000多倍。这种活性大幅提升归功于对CPDzyme不同构建模块的精确选择和排列，使得各组分发挥出协同催化的作用。此外，G4-Hemin-KHRRH可以在广泛的非生理条件下使用，如有机溶剂，95℃的高温和广泛的pH值（从2到10）条件下，仍保持较好的催化效果，突破了天然过氧化物酶的局限性，该方法为设计更高效的人工酶开辟了广阔的前景。
原文
Xiaobo Zhang, Dehui Qiu, Jielin Chen, Yue Zhang, Jiawei Wang, Desheng Chen, Yuan Liu, Mingpan Cheng, David Monchaud, Jean-Louis Mergny, Huangxian Ju, and Jun Zhou. Chimeric Biocatalyst Combining Peptidic and Nucleic Acid Components Overcomes the Performance and Limitations of the Native Horseradish Peroxidase. J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 4517−4526. https://doi.org/10.1021/jacs.2c11318.
