ACS Nano丨AIEgen 共轭相分离肽通过凝聚诱导发光照亮细胞内 RNA

大家好，今天给大家分享一篇2023年4月发表在ACS Nano上的AIEgen-Conjugated Phase-Separating Peptides Illuminate Intracellular RNA through Coacervation-Induced Emission。通讯作者是上海交通大学材料与工程学院的宋阳副教授，课题组的主要研究方向为固有无序蛋白材料、基于液态细胞器的仿生医学材料及其生物医学应用。

1. 研究背景

液液相分离（Liquid−liquid phase separation, LLPS）是指二元或多元混合物在一定条件下分离为不同的相。生理条件下，LLPS是构成液态无膜细胞器、核仁等重要细胞液态结构单元的物质基础，通常由核酸-核酸、核酸-蛋白、蛋白-蛋白复合物介导。这类复合物可以根据不同的环境信号周期性地凝结和溶解，感受外界环境的刺激而发生动态可逆的相变，参与应激反应、执行生物信号传导、形成胞内隔室、加速RNA酶催化反应、调控细胞周期和基因表达等多种细胞学功能，图1。

 

图1 细胞中的LLPS凝聚体能感受外界环境的刺激而发生动态可逆的相变，执行多种细胞学功能。

基于无膜细胞器的启发，相分离肽（phase-separating peptides ，PSPs）被设计成对pH、盐离子等化学环境刺激响应的生物传感器。这类多肽材料往往具有较高的分子量和良好的水溶性，从而克服相分离过程中因熵变造成的热力学能障。然而，目前在开发用于细胞内环境的功能性PSPs仍存在挑战。首先，大多数PSPs通常是具有20 - 200个氨基酸的长肽，限制了其作为胞内探针、疫苗/药物递送载体、基因编辑工具的应用潜力。其次，大多数天然PSPs缺少有效的荧光基团，难以满足生物显影、光诊疗等实际应用需求。

2. 科学假设

针对以上问题，研究人员基于PSPs的LLPS原理，将具有聚集诱导发光（aggregation-induced emission luminogen, AIEgen）效应的荧光剂四苯基乙烯（TPE）与PSPs的重复片段(RRASL)_n进行偶联，猜想RNA与PSPs的聚集会触发TPE发光原的聚集，并放大RNA发光成像，图2。

图2 AIEgen偶联相分离肽探针示意图

3. 结果与讨论

3.1 荧光相分离短肽探针的构建

前期研究表明，(RRASL)_n (n = 1, 2, 3)的串联肽重复序列可与polyU RNA聚集形成液滴凝聚体。为了用强大的发光原标记这种重复肽，研究人员将具有聚集诱导发光效应的荧光剂与(RRASL)_n通过固相合成进行偶联，获得荧光相分离短肽探针TPE-(RRASL)_n（图3a）。随后，研究人员将polyU RNA与TPE-(RRASL)_n混合，溶液立即浑浊，形成球形颗粒状结构，并随着时间的推移发生融合，表现出类似液滴的特性。在紫外光源照射下，TPE-(RRASL)_n分子在液滴相中比在连续相中发出更亮的发光（图3b-c）。此外，溴化乙锭染色RNA发现，PolyU分子在液滴相中富集。TPE-(RRASL)_n和RNA在液滴阶段的共定位证实了TPE-(RRASL)_n/polyU凝聚物的形成（图3d）。

图3 TPE-(RRASL)_n/polyU液滴凝聚物的形成

为了理解TPE-(RRASL)_n/polyU凝聚物的组成，研究人员改变了TPE-(RRASL)_n与polyU RNA的比例，获得三种不同状态的复合物，即单相溶液（single-phase solution）、液态凝聚体（liquid coacervates）和类凝胶（gel-like aggregates）。当polyU和TPE- (RRASL)₂的浓度增加时，逐渐出现相分离的现象（图4a）。为了反映凝聚相的流动性，研究人员进行了荧光漂白实验，当RNA/peptide 浓度比例小于1，凝聚物表现为液态；RNA/peptide浓度比例大于1，凝聚物表现为固态（图4b-c）。

图4 polyU与TPE- (RRASL)₂间动态转变

3.2 荧光相分离肽的凝聚机制研究

为了了解发光剂TPE对TPE-(RRASL)_n/polyU形成凝聚物的贡献，研究人员将polyU分别与TPE-(RRASL)₂、(RRASL)₂和带有芳香氨基酸酪氨酸（Y）的Y(RRASL)₂混合，通过混合物浊度的转折点确定最小凝聚肽浓度（minimum concentration of coacervation，MCC），发现TPE-(RRASL)₂的MCC最低，其次是Y(RRASL)₂（图5a）。

前期研究已证明多肽/polyU凝聚体的形成依赖于电荷。因此，研究人员推测TPE片段是否通过电荷依赖（如阳离子- π相互作用）或电荷独立的分子间作用力（如π – π堆积）来促进LLPS凝聚体。他们分别测量了凝聚体的ζ电位，发现TPE-(RRASL)₂/polyU液体状聚集体 具有正ζ电位，而凝胶状聚集体带负ζ电位（图5b）。因此，TPE片段以正电荷依赖的机制促进LLPS（图5c）。此外，如果阳离子- π共轭作用有助于MCC的降低，则与纯静电吸引形成的(RRASL)_n/polyU凝聚相比，凝聚物在盐诱导电荷筛选中应具有更好的相稳定性。从浊度测量可以看出，当NaCl浓度从0增加到300 mM时，有利于TPE-(RRASL)₂/polyU凝聚体的形成（图5d）。因此，通过引入TPE并强化阳离子- π偶联，提高了TPE-(RRASL)₂/polyU凝聚体在生理盐溶液中的相稳定性。

图5 AIE发光剂与阳离子氨基酸之间的阳离子-π共轭促进凝聚体形成和增强凝聚体的生理稳定性

3.3 相分离肽偶联AIE发光剂的发光性能研究

研究人员进一步发现，在没有polyU的情况下，观察到TPE-(RRASL)_n的自发光亮度随重复次数n的增加而降低。当n=1时，PE-RRASL的疏水聚集产生强背景荧光；当n=2时，背景发光明显受到抑制；背景噪声在n = 3时几乎消失。这是因为长链阳离子多肽之间的静电斥力会在空间上阻碍TPE-(RRASL)_n的自聚集（图6a）。

为了探究TPE-(RRASL)_n的凝聚与发光之间的关系，研究者将TPE-(RRASL)₃的浓度固定为0.25 mmol·L⁻¹，polyU在生理盐水溶液中的浓度从0到300 μg/mL变化。在UV光源照射后用荧光光谱仪定量，结果表明聚集体的荧光强度随RNA浓度的增加而增加，直到TPE- (RRASL)_n/polyU聚集体转化为凝胶状聚集体。加入30 μg/mL的polyU RNA来中和正电荷并凝聚多肽后，双相混合物的发光显著增加，最高可达700倍（图6b-d）。RNA剂量依赖性的荧光增强可能是由于多价相互作用（如静电吸引、阳离子- π共轭、π - π共轭和疏水力）限制TPE片段中芳环的自由旋转，导致发光增强。

图6 TPE-(RRASL)_n通过与polyU RNA形成凝聚体放大荧光信号

3.4 荧光相分离肽探针用于胆囊癌细胞SGC-996的胞内RNA显影

由于TPE-(RRASL)_n的RNA剂量依赖性发光，研究人员进一步推测TPE-(RRASL)_n是否可以用作为癌细胞成像的RNA探针。随后，研究团队将这种荧光相分离短肽探针用于肿瘤细胞RNA的标记显影。作为概念验证，他们将TPE-(RRASL)_n与人胆囊癌细胞系SGC-996孵育2小时，TPE-(RRASL) ₂和TPE-(RRASL)₃都能有效穿透细胞膜，定位到细胞核内。当使用标准RNA染料SYTO 13染色细胞内RNA时，观察到TPE-(RRASL)_n与SYTO 13共定位（图7a-c）。以上分析表明，TPE-(RRASL)_n可以转运到细胞核内，与胞内RNA结合实现活细胞成像。此外，TPE-(RRASL)₂在高浓度时也没有表现出明显的细胞毒性。同时，与DAPI、Hoechst、SYTO 13等商用核酸染料相比，TPE-(RRASL)₂毒性较小，这是由于TPE-(RRASL)₂与RNA分子的弱可逆结合（图7d-e）。此外，研究表明甲基-β-环糊精（MβCD）可以通过胆固醇依赖机制阻止TPE-(RRASL)n的内化，表明TPE-(RRASL)_n分子通过脂质载体穿透细胞膜（图7f）。

图7 TPE-(RRASL)_n/polyU探针用于胞内RNA显影，细胞毒性低，其穿膜机制与脂阀的运载相关。

总结

本篇研究中，作者将发光材料TPE与短相分离重复肽(RRASL)_n偶联，通过相分离进行荧光信号增强，实现细胞内成像。TPE使相分离肽的MCC降低了一个数量级，并在生理盐离子浓度下具有良好的稳定性。此外，在高于MCC的浓度下，TPE-(RRASL)_n通过脂筏有效地穿过细胞膜，转运到细胞核，点亮细胞内RNA，可用作活细胞成像的RNA传感器。

原文链接

Yang S, Yu H, Xu X, et al. AIEgen-Conjugated Phase-Separating Peptides Illuminate Intracellular RNA through Coacervation-Induced Emission, published online ahead of print, 2023 Apr 24, ACS Nano. doi:10.1021/acsnano.2c12072