Nat Commun丨自动化设计无细胞表达系统中生物标志物蛋白的核糖开关
今天分享的文献是2023年4月发表在nature communication的文章，题目是Automated design of protein-binding riboswitches for sensing human biomarkers in a cell-free expression system。
作者是来自宾尼法尼亚州立大学的Howard M. Salis教授，Salis教授将模型与优化算法相结合，自动化设计具有生物学功能的DNA序列，称之为DNA编译器，并使用这种方法对合成微生物进行编程，以进行化学物质的检测。
背景
基于核糖体的无细胞传感器，已用于小分子和化学毒素分子等检测，但尚未用于蛋白领域。作者在之前的工作中，开发了一种称为Riboswitch Calculator的翻译调节核糖开关生物物理模型，将统计热力学与计算优化相结合，自动化设计核糖开关。本文利用蛋白结合RNA核酸适体，进一步将Riboswitch Calculator的应用范围拓展到了靶标蛋白核糖开关的设计。
结果
图1. 蛋白质传感核糖开关和无细胞核糖开关表征的设计
模型输入信息主要包括，RNA核酸适体的序列及其二级结构，蛋白质和RNA核酸适体的结合自由能，以及输出信号蛋白（mRFP1）的编码序列，随后Riboswitch Calculator会计算出可供使用的核糖开关序列（图1A）。既往研究发现，细胞和无细胞系统中的基因表达对蛋白质配体或额外遗传信息载体的加入敏感，因此研究人员设计了no-aptamer control，即无适体对照组，含有无RNA 核酸适体的标准5’ UTR，以便于测量外源蛋白引起的非特异性变化（图1B、C）。
图2. 蛋白质传感核糖开关的设计与功能
针对3种靶蛋白（MCP、mCRP、and IL-32γ），作者利用Riboswitch Calculator共设计了 30条核糖开关序列，包括ON switches（激活mRFP1表达）和OFF switches（抑制mRFP1表达）（图2A）。其中，MS2-ON Riboswitches体系在扣除背景后，荧光增加了5.5-10.8倍；而在MS2-OFF Riboswitches体系中，荧光下降了2.5-5.3倍不等（图2B、C）。作者发现mCRP-OFF switches对质粒表达的mCRP无反应，即可能无法识别未发生糖基化的mCRP。同样的, mCRP-OFF switches体系存在一定程度的非特异性效应。而IL 23γ-OFF switches并没有显著的非特异性影响（图2E）。
图3. 结构和能量对riboswitch功能的影响
作者随后探究核糖开关的机制，以解释蛋白质与RNA适体的结合如何引起翻译的激活或抑制。在核糖体结合之前，mRNA折叠成稳定的结构，其中适体结构域和SD序列通过碱基配对相隔离。在核糖体形成起始复合物后，mRNA结构发生显著重排，包括在N末端CDS区域内抑制结构展开（图3A）。对于OFF switches，在系统缺失MS2时，M7o riboswitch折叠成高度稳定的结构（图 3B），其中RNA适体区域和SD序列隔离开来，不利于与核糖体结合。然而，一旦MS2与mRNA结合，初始和最终mRNA结构状态均需要进行重构，更加不利于核糖体结合 (图3B)。总之，该模型可一定程度上理解MS2如何结合到RNA适体区域，并引起riboswitch mRNA较大的结构重排列来控制核糖体结合自由能和翻译起始效率。
图4 . Riboswitch响应器的剂量效应
作者选择最佳的3个核糖开关（M2、C5、and I2），并检测不同浓度靶标对输出信号的影响。图4中蓝点表示测量的 mRFP1 荧光水平、归一化水平以及激活或抑制效率；红点指在相同配体条件下无适配体对照组对应的荧光值。需要特别指出的是，当mCRP浓度高于2500 nM时，靶标本身对感受器的抑制作用则过强。I2 switch无适配体对照组无明显荧光变化，但其无法检测皮摩尔范围内的IL32γ水平，这是区分人血清中正常水平和升高水平所必需的，这意味着I2 感受器在临床样本的检测中表现一般。
图5. mCRP适配体放置在5′UTR的standby site抑制基因表达
作者研究了由蛋白质结合适配体区域诱导的翻译抑制机制。当蛋白质特异性结合到mRNA的适配体区域时，翻译抑制可能由空间位阻施加或mRNA结构的变化（图5）。
图6. 通过核糖开关计算器优化体外蛋白核糖开关
Riboswitch Calculator计算器可通过量化结合自由能的变化来预测核糖体与mRNA的结合程度。在改变核酸适体保守区域序列长短后，对模型的预测会产生很大影响（图6D）。因此，准确预测核糖开关功能，需要正确输入蛋白质配体的浓度，蛋白质与其各自适体的结合自由能，以及在其蛋白质结合状态下“锁定”的实际适配体结构。
总结
作者构建了针对3种靶蛋白的共30 riboswitches，实现了蛋白的无细胞检测，探究了OFF/ON riboswitch的作用机制可能与空间位阻和构像改变有关。但是所设计的多个riboswitchesc传感器体系均有不同程度的非特异性信号输出。目前，作者针对mCRP没能设计出有效的ON riboswitch；IL-32γ riboswitch检测范围不能满足临床样本需求。总之，作者结合基因编码生物传感器和无细胞表达平台，在一个紧凑、低成本的设备中实现多重蛋白质的检测，为临床样本检测提供更多可能。
