​​​​Nat Commun丨用于哺乳动物细胞表达的基因编码DNA Origami

大家好，今天给大家分享的是2023年2月发表在Nature Communications上的“Gene-encoding DNA origami for mammalian cell expression”。

作者介绍：

Hendrik Dietz教授2007年于德国慕尼黑工业大学获得博士学位，并在美国哈佛大学医学院William Shih实验室从事博士后研究，2009年加入德国慕尼黑工业大学，现为生物物理系主任。Dietz教授在以DNA为基础材料的生物大分子组装方面开展了一系列创新性工作。 

研究背景：

定制基因在细胞中的传递和表达推动了重大科学发现，并支撑了越来越多的医学和技术应用。将遗传物质传递到特定的细胞或组织仍然是一个重大的挑战。包装、传递和表达所需的核酸通常必须以特定的应用程序的方式来处理。在这里，研究人员研究了设计合成DNA折纸支架序列和DNA折纸物体结构的决定因素，使这些物体中DNA分子内编码的基因能够被哺乳动物细胞表达。他们建立了一个功能终点—靶基因的表达，以帮助开发DNA折纸未来的基因传递和潜在的基因治疗应用。

结论：

1. 基因由DNA折纸表达，与基因位置或折纸形状无关

研究人员创建了一个定制的圆形ssDNA支架（图 1a），用于表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，并使用两个可观察值来用作基因表达效率的代表：转染效率和平均荧光强度(MFI)。并使用电穿孔将DNA折纸直接传送到细胞，以关注直接影响表达的参数。他们定制的EGFP支架通过噬菌体产生，并将支架有效地折叠到设计的目标对象中（图 1b）。为了研究基因在DNA折纸中的空间位置是否影响表达，研究人员设计了两个20螺旋束 (20HBs) 变体，其中EGFP基因位于多层DNA折纸的外部 (20HB-ext) 或内部 (20HB-int)（图 1b）。电穿孔后HEK293T细胞中的两种20HB变体均发生基因表达（图 1c），且没有显著差异。

图1 折纸结构基因的折叠和表达

为了阐明纵横比是否影响表达，研究人员设计了一个长约114 nm、长约69 nm和长约42 nm的螺旋束 (分别为12HB、20HB、32HB)，所有的EGFP基因和识别序列均在外部（图1b）。当递送至HEK293T细胞时，20HB和32HB样品的转染和表达效率没有显著的差异（图 1e）。相对于20HB和32HB，12HB样品的转染效率略有下降。

因此，就转染和表达效率而言，在测试DNA折纸组中，目的基因是如何包装的并不重要。所以DNA折纸的展开是基因表达的必要条件，研究人员用无法展开的EGFP编码对象测试了这个推论，他们在20HB-ext和20HB-int的staple中加入了额外的胸苷残基，通过UV点焊接实现内部交联。研究人员将UV点焊接20HB变体输送到HEK293T细胞时，他们发现EGFP信号几乎完全被抑制（图 1c）。虽然暴露于紫外线辐射也会对质粒的基因表达产生抑制作用，但共价交联的DNA折纸对基因表达的显著的抑制支持了该推论，即DNA折纸必须在基因表达之前展开。

2. 启动子区域的靶向设计增强了基因表达

研究人员观察到，与单独施用 ssDNA 支架相比，电穿孔预混合的、非退火的ssDNA支架和staple的混合物（不形成结构化物体）导致转染效率略高 (图 1c、e)。于是假设部分关联发生在staple和支架之间，导致启动子区域周围的双链DNA区域增强基因表达。并重新设计了20HB对象，以在启动子区域中加入没有交叉的长连续staple片段，从而产生一个结构，该结构具有连续的93-mer和154-mer的staple，位于CMV启动子 5' 起始区域的表达区域两侧，并且在polyA序列的 3' 端（分别为20HB-LP和20HBLPv2）。研究人员受部分双链乙型肝炎基因组启发，设计了一个200-mer的staple作为CMV的 5' 起点和polyA的 3' 末端之间的夹板，形成部分双链展开时的圆形结构 (20HB-Circ)（图 2b）。与标准20HB staple途径相比，将这些对象递送到细胞中导致20HB-LP、20HB-LPv2和20HB-Circ的基因表达效率提高50%（图 2d）。
        接下来，研究人员确定支架上靶基因的方向是否影响基因表达。由于支架是ssDNA，因此编码链的传递需要在转录前合成互补序列（模板链）。他们创建了一个具有反向互补基因序列的“模板链”支架（sc_EGFP2，图 2e）,并证明了其转染效率显著增加（图 2f）。然而，当模板链折叠到20HB DNA折纸物体中时，转染效率的差异就消失了（图 2f）。因此，20HB的整体转染效率不依赖于编码链或模板链作为支架。然而，相对于编码链作为支架的对象，研究人员观察到具有模板链支架的所有对象的EGFP平均荧光强度均有增加的趋势（图 2g）。

图2 通过staple设计和scaffold定位优化基因表达

3. 利用支架序列特征增强基因表达

为了进一步增强基因表达，研究人员在基于ssDNA AAV2表达盒的支架序列中加入了额外的特征，在支架中加入了Kozak、WPRE和ITR的几个特征序列，设计了sc_EGFP3/4/5/6（图 3a）。在所有情况下，研究人员观察到sc_EGFP3/4/5/6支架相对于原始的sc_EGFP1支架，转染效率和基因表达均显著提高（图 3b、c）。从“增强型”支架折叠的20HB样品与从sc_EGFP1支架折叠的20HB样品具有相似的转染效率，但相对于原始sc_EGFP1，图3c中“增强型”支架sc_EGFP3/4/5/6 折叠的20HB阳性细胞中MFI显著增加，这意味着支架中的附加功能增强了细胞内基因表达。

在研究者目前的讨论的设计中，ITR序列被隐藏在物体的双螺旋DNA结构域内，只有物体在细胞内变性后才可用。于是假设定位ITR序列基序可以进一步改善20HB的基因表达（图 4a，设计20HB-exL）。此外，还设计了一个20HB-exLP，在启动子的 5' 区域包含一个连续的154-mer staple，用sc_EGFP5和6支架编码。与使用sc_EGFP1支架的原始20HB设计相比，这些设计显示出高达两倍的转染增强（图 4b）和高达六倍和九倍的表达效率（图 4c，d）。

图3 来自替代支架序列的增强基因表达

图4通过支架序列设计增强基因表达
研究人员绘制了针对所有设计的相对EGFP的转染效率，以sc_EGFP1 20HB-ext 作为对照（图 5a）。样品分成三个簇，集群1由sc_EGFP1/2支架构建，具有高质量的折叠和高转染效率，但总体基因表达较低；集群2基于sc_EGFP3/4/5/6支架的对象，这些支架折叠质量低，转染效率低，但基因表达得到增强；集群3为改进的折叠质量对象，如sc_EGFP5/6支架的20HB-exLP，他们进一步提高了转染效率和基因表达。最后，研究人员通过改变滴定的材料量和改变电穿孔条件进一步优化转染效率，从而导致更高的转染效率和 MFI（图 5b )。

 

图5 转染总结及优化

4. 用于共转染的多重基因组装

研究人员设计了编码mCherry或EGFP表达的DNA折纸，以1:1、1:2和1:3 mCherry与EGFP的化学计量比进行组装和递送（图 6a、b）。单个基因“块”通过形状互补的对接位点相互作用，这些对接位点含有序列互补的粘性末端（5或8个nt）。同时设计5个胸苷长单链悬垂，使其对接位点失活（钝化），以便进行对照(图6c)。对于钝化的mCherry和EGFP，单体的 1:1 化学计量混合物，对EGFP和mCherry表达呈阳性的细胞群进行测量，得到的共转染效率约为5.4%；相比之下，当使用包含mCherry和EGFP作为可表达基因的预组装二聚体时，研究人员观察到共转染效率约为17.5%（图 6d，f），提高了近四倍，表明了这两种成分的转染和表达是相关联的。

最后，研究人员以二聚体、三聚体和四聚体的形式提供了mCherry:EGFP比例为1:1、1:2和1:3的多聚体折纸对象。多聚体折纸对象的摩尔浓度在样品中保持不变，因此共转染效率大致保持不变（图 6e，灰）。然而，EGFP的表达水平与折纸内存在的单体数量成正比（图 6e，绿）。使用荧光显微镜对细胞进行成像可以发现钝化的对象和组装成功的对象（图 6f，黄色为EGFP与mCherry组装对象，绿色为EGFP，红色为mCherry）。因此，研究人员通过在高阶DNA折纸组装中将基因“点击”在一起，成功地以设计好的化学计量比传递和表达基因。

图6 多聚体折纸组件的递送使基因以确定的比例共同递送成为可能

总结：
基因表达的先决条件是DNA折纸在细胞内环境中展开。然后，基因可以从ssDNA支架链上表达。通过有针对性地设计辅助staple，最好位于合成支架表达盒的上游，并包含Kozak、WPRE、ITR、ITR*等特征，可以显著提高基因的表达效率。总之，研究人员研究了基因折叠成DNA折纸后的表达情况，并确定了支架和结构设计特征，以实现高效的基因表达。同时展示了在受控化学计量比下基因的共转染情况。本文设计的支架提供了一个报告基因框架，来量化基于DNA折纸的基因传递系统的功能，并探测DNA折纸的细胞内命运。通过用定制蛋白质编码序列替换荧光报告蛋白基因，支架也可以适应定制递送目的。此外，通过高阶DNA折纸组装控制递送的定制基因可以促进治疗或基因回路的协同基因等基因递送。未来的工作将包括进一步优化多组分折纸基因组装。然而，基于该系统，可以设计一组“可点击”的DNA折纸，可以与不同组合的引导RNAs或其他辅助基因在受控的化学计量比中进行多重复用，以实现共同传递。

Kretzmann J A, Liedl A, Monferrer A, et al. Gene-encoding DNA origami for mammalian cell expression[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 1017. https://doi.org/10.1038/s41467-023-36601-1