Nat Biomed Eng. 丨通过消耗胆固醇使癌细胞变硬强化过继性T细胞免疫治疗
大家好，本次分享的文献是2021年12月发表在Nature Biomedical Engineering上的Cancer-cell stiffening via cholesterol depletion enhances adoptive T-cell immunotherapy。这项工作首次提出了癌细胞借助细胞低硬度这一物理免疫检查点削弱T细胞的力量以逃避抗肿瘤免疫，为提高免疫疗法应答率和开发新型免疫疗法提供了一个全新的方向。
作者介绍
该成果出自瑞士洛桑联邦理工学院唐力教授团队，他们的研究方向主要集中在代谢免疫工程、化学免疫工程和机械免疫工程（图1）。
图1.作者介绍
研究背景
肿瘤采用免疫检查点逃避抗肿瘤免疫，如肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上的PD-1结合使T细胞无法杀伤肿瘤细胞。采用免疫检查点抑制疗法，如使用抗PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1的免疫检查点可以重新激活抗肿瘤免疫，并取得了显著的临床效果。然而，目前以PD-1/PD-L1单抗为代表的传统免疫检查点抑制疗法在临床应用中的总体应答率仅在10%至30%之间，因此确定并靶向新的免疫检查点将有益于肿瘤治疗。尽管人们在寻求新的生物化学检查点方面做了巨大努力，但涉及生物力学信号的潜在抑制途径在很大程度上仍未被探索。虽然肿瘤组织往往比相应的正常组织硬，但恶性癌细胞通常比非恶性细胞软，而且，低硬度与癌细胞的转化、恶性和转移有关。此外，T细胞能够感知机械环境，在免疫突触处施加力量以增强对靶细胞的细胞毒性，当T细胞接触到硬度较低的基质或靶细胞时细胞骨架力和效应细胞因子的产生将大大减少。受这三点启发，作者猜测癌细胞利用自身的低硬度作为物理免疫检查点，削弱T细胞机械力，抵抗T细胞介导的细胞毒性。
研究结果
1.癌细胞膜富含胆固醇
已有研究表明，较高的膜胆固醇水平与细胞硬度低相关，因此作者测定了肿瘤组织以及癌细胞中的胆固醇水平。组织学分析显示：与相应的健康组织相比，B16F10小鼠黑色素瘤表现出更高的胆固醇水平（图2a）；Amplex Red 胆固醇测定法也发现B16F10肿瘤的胆固醇含量比周围的皮肤和肌肉组织分别高4倍和1.7倍（图2b）；在人类多种肿瘤的活检中也发现胆固醇水平被上调，包括小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、结肠癌和肝癌（图2c），这说明在不同类型的癌症中胆固醇失调可能是一个共同的特征。在细胞水平上：4T1小鼠乳腺癌细胞（图2d）以及EG7癌细胞（图2e）的细胞膜胆固醇含量均比周围正常水平高。以上实验表明癌细胞膜富含胆固醇，这可能是癌细胞变软的原因之一。
图2.癌细胞膜富含胆固醇
2.通过调节膜胆固醇水平控制癌细胞硬度
为了进一步验证癌细胞借助膜胆固醇上调使自己变软，并找到改变癌细胞硬度的方法，研究者试图调整细胞膜胆固醇水平并测定细胞硬度变化。体内外实验证明，单独使用MeβCD可以降低肿瘤细胞膜的胆固醇含量（图3a）；而使用胆固醇/MeβCD 复合物则会增加癌细胞膜胆固醇含量（图3b）。接下来，研究者通过原子力显微镜(AFM)测量了单个B16F10癌细胞的硬度，发现膜胆固醇含量增加后细胞硬度降低了40%，而胆固醇含量降低后硬度增加了140%（图3c）。为了能够高通量测量细胞的硬度，研究者采用变形性流式细胞术检测细胞形变，形变越大则硬度越低（图3d）：在小鼠B16F10和人Me275癌细胞中，使用MeβCD降低膜胆固醇含量后细胞形变明显减小，表明细胞硬度增加；补充胆固醇则增加了细胞形变，表明细胞硬度降低（图3e）。这些结果进一步证明，胆固醇在细胞膜富集有助于癌细胞软化，而通过MeβCD降低膜胆固醇含量可以增加癌细胞硬度。
图3.通过调节膜胆固醇水平控制癌细胞硬度
3. 软化癌细胞损害T细胞介导的细胞毒性
作者接下来探索了变软的癌细胞是否能够抵抗T细胞介导的细胞毒性。体外试验中，由于基质硬度影响细胞力学，作者将B16F10癌细胞接种在不同硬度（55kPa，143kPa，玻璃）的基质上，并与活化的CD8+ T细胞共培养，当补充外源胆固醇后，B16F10细胞的存活率增高，表明肿瘤细胞硬度降低可以抑制T细胞介导的杀伤作用（图4a）。而在体内实验中，补充胆固醇同样抑制了CD8+ T细胞的抗肿瘤效果（图4b）。体内外实验均证明癌细胞低硬度可以作为物理免疫检查点抑制T细胞介导的杀伤作用。
图4. 软化癌细胞损害T细胞介导的细胞毒性
4.硬化癌细胞增强过继性T细胞疗法的疗效
研究人员尝试开发一种增加肿瘤细胞硬度的方法，从而增强免疫治疗效果。体外研究中，MeβCD硬化后的肿瘤细胞在三种不同硬度的基质上均显著增加了对T细胞杀伤的敏感性（图5a）；而MeβCD硬化后的悬浮细胞EG7-OVA同样对T细胞毒性更加敏感（图5a）。体内研究中，白介素-15超级激动剂（IL-15SA）支持下的CD8+ T细胞过继性免疫细胞疗法（ACT）虽延缓了B16F10荷瘤小鼠中肿瘤的生长，但未能实现对肿瘤进展的持久控制；联合MeβCD干预后，ACT的治疗效果得到增强，41.7%的小鼠得到了治愈；而单独使用MeβCD没有治疗效果，这表明CD8+ T细胞的存在对加强杀伤硬化靶细胞是必需的（图5b-c）。因此，体内外实验均表明使用MeβCD提高癌细胞硬度可作为一种干预手段提高免疫治疗的疗效。
图5. 硬化癌细胞增强 ACT的疗效
5. 硬化癌细胞增强T细胞机械力和细胞毒性
研究者发现该物理免疫检查点的作用机制不依赖于已知T细胞杀伤的生物化学通路，因此他们进一步研究是否生物力学因素在其中起关键作用。使用牵引力显微镜(TFM)测量了T细胞在不同硬度基质上施加的作用力大小，发现CD8+ T细胞在较硬的基质上施加了更大的力（图6a-b）。此外，共聚焦荧光成像显示，T细胞与基质界面形成了免疫突触（IS）（图6c），且免疫突触中纤维状肌动蛋白(F-actin)的积累量随着基质变硬而显著增加（图6d）。已有研究表明富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)的磷酸化水平与T细胞作用力大小呈正相关，为了比较T细胞对不同硬度靶细胞的作用力，他们分别测量了与天然、软化或硬化B16F10癌细胞共培养的CD8+ T细胞中的Pyk2磷酸化水平，发现与硬化B16F10癌细胞共培养的CD8+ T细胞具有更高的Pyk2磷酸化水平（图6e），这表明T细胞对硬化的癌细胞施加了更大的力。最后，研究者用激动蛋白抑制剂LatA处理CD8+ T细胞以抑制T细胞力，这显著降低了共培养癌细胞的裂解率，并且CD8+ T细胞对硬化癌细胞增强的杀伤效果也不再显著（图6f）。这些结果表明T细胞对硬化癌细胞的增强杀伤作用是由T细胞施加的作用力介导的。
图6 硬化癌细胞增强T细胞机械力和细胞毒性
结论
发现和靶向新的免疫检查点有助于提高患者对癌症免疫治疗的反应率。在这项工作中，他们确定了细胞低硬度可以作为生物力学基础的物理免疫检查点，癌细胞利用这个检查点损害免疫突触处的T细胞作用力，从而逃避抗肿瘤免疫(图7)。通过消耗癌细胞膜胆固醇来硬化癌细胞，可以克服该物理免疫检查点以增强 T细胞作用力和细胞毒性，并最终显著加强了细胞过继性T细胞疗法的疗效（图7）。
图7. 物理免疫检查点以及该检查点的克服
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