NATURE丨Dicer 产生小 RNA 的序列决定因素

 

大家好，今天分享的文献是今年2月在nature上发表的一篇文章，题为《Sequence determinant of small RNA production by Dicer》。

作者介绍

文章的通讯作者是韩国国立首尔大学（SNU）教授、美国科学院外籍院士、韩国科学院院士V. Narry Kim，也是韩国基础科学研究所（IBS） RNA研究中心的创始主任。

她的实验室研究RNA介导的基因调控，尤其是microRNA的生物发生途径；发现了干细胞特异性miRNA。该实验室还开发了一种技术，可以对mRNA尾部进行全基因组分析，并揭示了mRNA尿苷化对mRNA转换的重要性。

研究背景

MicroRNAs （miRNAs）的生物合成过程是由编码microRNA的基因转录为pri-miRNA。pri-miRNA由核糖核酸酶（RNase） III家族的酶Drosha剪切得到长度约为70个核苷酸（nt）的pre-miRNA。pre-miRNA转运到细胞质中并由RNase III酶Dicer剪切为长度约22nt的成熟miRNA。后者与其他蛋白质组成RISC（RNA-induced silencing complex），从而引起靶mRNA降解或者翻译抑制。

Dicer能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入、转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，并生成miRNA（micro RNA）和siRNA（small interfering RNA）驱动RNA干扰。一直以来，人们认为人类Dicer起到“分子尺”的作用，测量底物pre-miRNA的5 '端和3 '端约22 nt的距离并切割。但是该规则不能完全解释pre-miR-324或其突变型的加工模式，这表明可能存在一种Dicer参与的尚不清楚的机制。因此作者在本研究中试图探究Dicer识别底物的特异规律。

 

 

文章内容

1.Dicer对底物识别的序列依赖性：GYM基序

         为了研究Dicer对底物的识别是否具有一定的序列依赖性，作者在pre-let-7a-1与Dicer接触的茎的上部的一个5 bp小窗口（相对于3p链的裂解位点−1到+3）内随机化序列，大规模随机合成了不同变异型。在与纯化的人Dicer蛋白短暂孵育至5%的底物被切割后，通过凝胶电泳分离纯化并筛选出未被剪切的pre-miRNA进行精确定量测序（AQ-seq）。为了量化Dicer对不同片段的剪切效率，作者通过将每个突变性反应前的占比除以反应后未切割片段的比例，得到“裂解分数”（cleavage score）。

 

作者检查了得分在前0.1%内的pre-miRNA突变型，发现位置1上错配发生最多。同时，在−1和0位，最常见的碱基配对方式分别为5’-C-G-3’和5’-G-C-3’。在位置1，G最少，C在两条链上均最多。序列偏好性在位置2和3上不太明显。

为了增加测序深度，作者进行了第二轮大规模并行分析，使用两个3bp窗口（随机位置−1到1和1到3）。这次分析使用了另一种结构相对简单的pre-miRNA骨架pre-miR-374b。在底物池的10%、20%或30%被裂解的条件下进行反应。裂解分数随着孵育时间的增加而增加，且在不同条件之间表现出很强的相关性。

作者发现区域−1到1可能在pre-miRNA处理中发挥重要作用，并且与其骨架结构无关。在另一个区域1到3的窗口中，裂解得分在不同突变型之间没有显示出很大的差异，这表明该区域的影响小于区域−1到1。

作者还发现碱基正常配对总体上有利于Dicer的剪切，但仅在位置1发生错配的情况下得到的裂解分数最高，其中C-C错配的影响通常最强。而且无论研究的突变窗口、RNA骨架和反应时间如何，几乎在所有条件下都可以检测到位置1的序列偏好性。

因此，作者将这个长3nt的基序命名为GYM：即3p链上的−1，0和1位置分别为正常配对的G，正常配对的嘧啶U/C，以及错配的C或A（主要是C）。作者设计了一个名为“GYM分数”的指标来表示基序的强度，即通过在pre-let-7a-1和pre-miR-374b裂解率20%的情况下得到的“裂解分数”的平均值，并将平均值归一化（0-100）。

 

2.GYM基序影响dsRNA处理效率和裂解位点

作者使用含有各种GYM 基序的pre-let-7a-1进行了体外处理分析，发现分数最高的基序（GCm, GYM得分94）剪切效率最高，位置1配对的G-C（GCp，得分38）变异型和一个位置−1和0为UA（UAm，得分30）的变异型其次，三个位置的碱基均不同的变异型（UAp，得分14）效率最低，说明配对的GY部分和不匹配的M部分都很重要，具有相加效应。

接下来，为了检测基序在细胞中的活性，作者将GYM变异型整合到人工pri-miRNA发夹中，嵌入荧光素酶报告基团的3’非翻译区域。荧光素酶水平没有被GYM基序改变，表明该基序不影响Drosha的处理；成熟miRNA水平则与GYM评分相关。

作者又设计了类似于pre-miRNA的双链，其中均包含高得分但位置向末端移动了1 bp的GYM基序，发现部分裂解位点也偏移了1bp。通过比较发现GYM基序对裂解位点的主要影响在于不匹配的M，GC二核苷酸强化了该影响。

这些结果表明，GYM基序不仅促进了高效的加工，也作为裂解位点的重要决定因素。

为了进一步研究GYM基序如何与Dicer的末端计数规则相互影响，作者制备了一系列具有1-3nt突出末端的dsRNA。发现高分基序 （GCm）存在的情况下，无论突出末端长度如何，都能得到同样的产物，低分基序（UAp）则不行。因此，最佳的GYM基序是裂解位点决定的主要决定因素，当发生冲突时，它会覆盖末端计数规则。

 

3.dsRBD结构域是识别GYM基序的关键

为了从机制上深入了解GYM基序的识别，作者构建了Dicer-dsRNA复合体在剪切状态下的结构模型。发现c端双链RNA识别结构域（dsRBD）位于GYM基序附近。进一步研究发现缺乏dsRBD的Dicer变异型（ΔdsRBD）无法识别位置1的错配，证实了dsRBD在感知错配方面具有关键作用，而位置−1和/或0的碱基可能被其他结构域识别。

作者又发现ΔdsRBD不再受GYM基序位置的影响。这些结果支持了dsRBD在识别GYM决定裂解位点方面的作用。

作者进一步发现在组成dsRBD第一个α-螺旋上有一个高度保守的精氨酸残基（R1855）非常靠近位置1的碱基。之前的癌症基因组学研究发现了导致此处精氨酸变为亮氨酸（R1855L）的点突变，这意味着它造成了pre-miRNA加工中的缺陷。该位点突变为亮氨酸（R1855L）或丙氨酸（R1855A）都减少GYM基序对错配的特异性识别。R1855A/E1859A双突变也失去了识别位置1错配的能力。

综上所述，Dicer识别错配M主要是利用dsRBD高度保守的R1855和E1859残基来确保高效和精确的处理。

4.GYM基序在miRNA生物合成中的作用

接下来，作者提出了GYM基序是否与内源性miRNA成熟相关的生物学问题。作者通过细胞实验发现dsRBD缺失或R1855突变时，miRNA丰度降低。

dsRBD的改变降低了pre-miR-27b、pre-miR-21、pre-let-7d、pre-let-7f-1和pre-let-7i上的Dicer活性，且降低了GYM基序对剪切效率的影响。二者相互作用促进了miRNA在细胞和体外的处理。

作者还检测到许多miRNAs的剪切位点受到dsRBD改变的影响，导致种子序列改变和/或链突变。

同时GYM基序对不同的miRNA有不同的影响，可能是因为GYM基序根据其相对位置与末端计数机制合作或竞争。

 

5.GYM基序在生物进化中的意义

为了进一步了解GYM 基序在其他物种中的功能相关性，作者使用同样底物检测了果蝇Dicer-1（Dcr-1）。其同样表现出对高分GYM 基序的偏好和裂解位点的改变。因此，GYM 基序可能在后生动物的pre-miRNA加工中发挥高度保守的作用。

在人类pre-miRNA中，与邻近位置相比，−1-1位置的GYM评分更高。且在多个后生动物物种中都观察到这种位置特异性富集。

值得注意的是，异构体较少的miRNAs比异构体较多的miRNAs表现出更强的位置富集。作者将pre-miR-9（其两个3-bp滑动窗口之间的基序具有相同的GYM分数）靠近尾部的窗口中引入了一个较弱的GYM变异型，使上面的基序更加“突出”。该情况下，pre-miR-9的剪切方式更加单一。

这一观察结果表明，相对于邻近位置“突出”的GYM基序促进了单一miRNA的产生，而“不那么突出”的GYM基序会产生多个异构体以及多样化的miRNA功能，这可能解释了为什么大多数（但不是全部）人类pre-miRNA进化为具有突出的GYM基序。

6.GYM基序加强RNA干扰

进而作者用不同分数的GYM基序构建了短发夹RNA（shRNA）和依赖Dicer加工的siRNA小干扰RNA（DsiRNA）。高分GYM基序均能促进更高siRNA产率和最强的基因沉默活性。

 

总结

这项新的研究发现，在切割位点附近有一个高度保守的顺式作用元件，即“GYM基序（GYM 基序）”，可促进Dicer高效而精确地切割pre-miRNA，增强RNA干扰。Dicer的dsRBD结构域负责识别GYM，二者共同作用影响miRNA合成。Dicer中一个与癌症相关的突变会破坏对GYM基序的识别。整个研究揭示了DICER识别底物的完整和保守的机制，并为我们理解microRNA生物合成提供了框架。它揭示了后生动物Dicer识别底物的共同特征，并提示其在RNA治疗和癌症治疗中的潜力。

 

文献信息

Lee, YY., Kim, H. & Kim, V.N. Sequence determinant of small RNA production by Dicer. Nature 615, 323–330 （2023）. https://doi.org/10.1038/s41586-023-05722-4