Nat Commun | RbFox蛋白通过不同的结合模式实现超凡特异性
大家好，今天给大家分享的这篇文献是2023年2月发表于Nature Communication的《Two distinct binding modes provide the RNA-binding protein RbFox with extraordinary sequence specificity》。
作者介绍
通讯作者是来自哈尔滨工业大学、生命科学与技术学院的杨帆，研究方向为液体核磁共振研究生物大分子相互作用的分子机制。
背景介绍
在真核细胞中，RNA结合蛋白（RBP）在调控基因表达方面起重要作用，这种调控方式的一个关键方面是RBP对其目标位点的特异性。确定RBP获得其特异性分子机制对于理解RNA生物学的规则和设计针对RBP和RNA相关过程的治疗策略至关重要。在具有最大特异性的RBP中，有三个密切相关的人类RbFox1-3，含有进化上高度保守的RNA recognition motif (RRM), 它们在pre-mRNA剪接、miRNA加工和其他RNA代谢步骤中发挥作用。RbFox特异性识别含5’-GCAUG-3’,但在体内表达量提高时，会以低亲和力结合非同源序列而发挥生物作用。即使现在拥有RbFox核磁共振结构，也未能为它自身这种非凡特异性提供有力的证据。
结果
RbFox亲和力分布呈双峰型
研究人员首先测量了RbFox对同源/非同源序列的亲和力(图1 a,b)，随后使用HiTS-Eq(High Throughput Sequencing Equilibrium Binding), 这是一种能够广泛测定RBP与RNA结合能力的技术。先建立一个由16384条随机组合成的7-nt RNA库，检测RbFox对于库中RNA的结合能力。结果显示，RbFox-RRM对于7-nt RNA的亲和力分布表现为双峰型（图1 g）：在亲和力低方面呈现一个又宽又强的峰，主要是非同源序列及其变体；对于同源序列及其变体则组成了一个高亲和力的强度极小的峰。这种双峰型的亲和力分布与通常RBP的单峰分布相比，RbFox表现极为不同。
图1 RbFox与所有7-mer RNA序列变体结合
定量结合模型表明RbFox具有两种结合模式
接下来，为了了解RbFox特异性的这些独特特征的决定因素，研究人员应用了定量结合模型。首先是绘制了1024个5-nt RNA变体中48个的亲和力值（图2 a），随后使用位置权重矩阵（Position Weight Matrix, PWM）和配对耦合(Pairwise Coupling, PWC)对上述HiTS-Eq结果进行定量分析。结果发现，PWM模型占据了75%数据差异，并且表明在所有核苷酸位置上对G有偏好（图2 b, c）。PWC预测值与实验值相关性达90%，发现G2-A4的取代会大大降低结合亲和力，但两种模型中5-nt的同源序列GCAUG都是以异常值存在(图2b, d)，说明RbFox的双峰型亲和力分布不能用单一的结合模式来解释，对于单一RRM的RBP拥有不同结合模式还未曾报道过。因此，研究人员假设RbFox分别以两种结合模式识别同源/非同源RNA序列。
图2 定量结合模型分析RbFox亲和分布
蛋白质突变体不同程度地影响两种结合模式
研究人员引入一个4个氨基酸残疾突变体RbFoxmut(图3 a，该突变体蛋白可以靶向拥有接近同源序列的pri-miRNA)，认为突变体会导致不同结合模式上有所差异。发现突变体与非同源序列亲和力有所提高（图3 b），还对其进行了同样的亲和力分布测定。与野生型相比，突变体蛋白的亲和力分布与多数RBP结果很相近，呈现单峰型，并向着高亲和力移动(图3 e)。突变体对于2号位的碱基严格性消失(图3 f)，允许容纳更多的5-nt非同源序列，也可能是导致蛋白对于同源序列亲和力略微降低的原因。突变体对同源/非同源RNA亲和力产生了相反的影响，有力地支持了RbFox拥有2种结合模式的想法。此外，数据显示，野生型的RbFox通过对非同源序列进行热力学惩罚来实现特异性。
图3 RbFox突变对亲和分布的影响
同源/非同源RNA在RbFox RRM中诱导不同结构
为了进一步探究两种结合模式上结构差异，研究人员对两条非同源RNA序列，RNA1(5’-UGCAUAU-3’)和RNA2(5’-UUCAUGU-3’)与RbFox进行核磁共振分析，并解析出RbFox-RNA1的溶液结构(图4)。两种结合模式有主要以下差别：首先，蛋白为结合RNA1，牺牲多个氢键相互作用以及π-π堆积作用，以灵活的多态性结合RNA；G6→A使R118失去了与G6 Hoogsteen face的氢键相互作用，转变为与A的Watson-Crick face的相互作用；还引起了U5氢键网络重排，U5与H120的咪唑环堆积作用消失，与N190和T192的氢键相互作用也消失（图4 a）；R118的侧链还扭转了一个比较大的角度，引起K117、E164和N190的重定向，α1、α2等多处也发生构象变化（图4 b），构象重排还导致电荷分布出现变化以适应非同源RNA序列。对于大部分融合的结构，F160的芳香环倾斜着与A6的基底堆叠。由于失去了与A6和U5的紧密接触，RNA结合链β1和β3从RNA上浮起，β2和β3环重新定向以更好地容纳非识别的RNA（图4 b）。在采集RbFox与RNA1数据过程中，核磁共振波谱的不稳定变化也支持了RbFox对于非同源序列RNA结合多态性。
图4 RbFox RRM与5′-UGCAUGU和5′-UGCAUAU结构的比较
讨论
特异性变化是决定RBP功能的关键因素，因此，确定决定RBP特异性的分子机制对于理解RNA生物学是必要的。本篇研究首次揭示了RbFox通过功能及结构上不同的结合模式来实现超凡RNA序列选择性。对于只含单一RRM的RBP来说，使用截然两种不同的结合模式来识别RNA还是一个新颖的概念。RbFox采用一种结合模式专门容纳具有高亲和力的同源RNA及其变体，而另一种结合模式容纳所有其他RNA，但亲和力明显降低。RNA-蛋白质相互作用的低亲和力受到RNA静电特性的限制，它促进了与蛋白质的 "非特异性 "相互作用，通常在低至中微摩尔范围内。因此，研究人员提出RbFox的双重结合模式是为了克服单一结合模式所带来的序列识别的物理限制。从结构和功能上看，构象重排向远离RNA界面的传播表明，RNA不只是被动地受到RBP调控，RNA也可以调控与相关RBP的结合，从而影响下游生物进程。
