JACS | 利用核酸适体邻近催化标记实现细胞选择特异性的多功能表面共价重构

大家好，今天与大家分享一篇近期发表在JACS的工作，题为“Cell-Selective Multifunctional Surface Covalent Reconfiguration Using Aptamer-Enabled Proximity Catalytic Labeling”。

作者简介：

本文的通讯作者是来自于南京大学化学化工学院、生命科学分析化学国家重点实验室的丁霖教授，

课题组的研究方向为糖分析化学和细胞成像。长期专注于细胞表面聚糖的成像和重构方法学研究。

研究背景：

生物体内各种生物进程依赖于细胞间的精确协作，其中细胞膜表面分子决定了细胞与周围环境的相互作用。对细胞膜进行分子重构或引入各种识别分子，能够赋予细胞特异性的感知能力，重塑细胞-细胞间通讯，在构建组织再生、人工信号通路方面有重要价值。

目前，具有空间特异性的细胞膜表面共价标记策略主要有两种：1、亲和结合驱动特异性位点的共价交联；2、基于过氧化物酶或生物素连接酶的邻近共价标记。其中，这些具有催化活性的酶通常具有以下特点；1、酶可将惰性的小分子底物转化为短寿命的活性物质（氧自由基、 活性酯等），并在以活性位点为中心进行扩散，从而对邻近的蛋白的氨基酸残基进行共价标价；2、共价标记的半径与反应物种的半衰期以及环境中淬灭剂的浓度有关；3、催化产生的反应物质具有膜不渗透的特点，因此轮廓结束于膜边界。然而，目前常用的标记方法通常为单一类型的标记，能够同时进行多重标记的策略非常少。基于此，本文构建了一种能够同时将不同类型的功能分子共价标记于细胞膜的策略，提高了多功能集成能力，增加了细胞操控的灵活性，拓展了细胞标记技术的生物应用。

示意图：HRP-Apt特异性结合混合细胞群中的靶细胞，介导多种酚修饰功能分子的细胞选择性标记，实现活细胞的多功能操控与多糖重构

基于此，作者将核酸适体（Apt）与辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）相结合，构建了核酸适体驱动的邻近标记（aptamer-enabled proximity catalytic labeling, APCL）平台，能够在复杂的混合细胞体系中，对靶细胞膜表面进行多功能修饰，实现了细胞间相互作用、多细胞组装以及细胞选择性多糖分子的示踪和重编程。

主要实验结果：

1. HRP-Apt标记机制

以生物素酚（BP）为模型，当H₂O₂存在时HRP能催化溶液中的酚羟基以及邻近蛋白质中氨基酸残基（Tyr）转化为具有高反应活性、半衰期短（＜1 ms）、具有邻近限制（＜20 nm）的酚氧自由基（BP·）和酪氨酸自由基（Try·）。在溶液中，BP·能与Try·或BP·形成BP-Try或BP-BP二聚体两种形式。基于此，作者通过sulfo-SMCC将HRP与核酸适体AptH和APtK共价偶联，实现细胞选特异性的共价标记。

图1. HPR和HRP-AptH在不同细胞系上标记性能的研究。

共聚焦结果表明，HRP-AptH处理后仅在靶细胞HL60观测到较强的荧光信号，信号强度随着浓度的增加逐渐增强，表明了良好的细胞选择性（图1）。为了探究HRP-AptH共价标记的机制，作者利用电喷雾电离质谱（ESI MS）对溶液中HRP-AptH的催化产物进行实时监测。

图2. HRP-AptH和HRP标记机制的研究。

质谱结果表明，当c_HRP大于2.31 nM时，溶液中BP信号峰消失，主要的产物表现为BP-BP二聚体（图2B）。提示溶液中自由基的主要形式为BP-BP，其半衰期短（＜ 1 ms）、扩散半径有限（＜ 20 nm），并未与Tyr·发生共价连接。而HRP-AptH组由于适体将HRP限制于靶细胞HL60上，在靶细胞附近产生足够的BP·，并与Tyr·充分发生共价连接（图2C-D）。

图3. APLC在混合细胞中的细胞选择性。

随后作者在混合细胞体系中对APCL细胞特异性进行了靶向验证。共聚焦及流式表明，HRP-AptH能够有效的区分出靶细胞HL60，并且标记效率显著优于共价标记（图3A-B）

2. APLC与其它标记分子

验证了APCL选择性共价标记的可行性后，作者进一步探索了该策略用于其它常见功能分子的标记，包括DBCO（互补基团为N₃）和TCO（互补基团为T_z）。作者首先在混合细胞中验证了该策略对靶细胞单独标记DP和TP的能力，随后对靶细胞采用了双重标记策略，并实现了对细胞的操控。

图4. 双功能APCL。

作者通过共聚焦证明了HRP-AptH能够成功的在靶细胞上分别及同时标记DP和BP分子，（图4A-C）。随后作者在Jurkat T细胞上进行BP和TP双重修饰后，通过N3-AptP（AptP靶向PD-L1受体）示踪了Jurkat T与MDA-MB-231细胞的相互作用（图4D）。流式结果表明，与非共价（AptP by affinity）标记相比，共价修饰的AptP增强免疫阻断的细胞杀伤作用（图4E-F）。

3. 重塑细胞间相互作用

在生物系统中，指导细胞-细胞相互作用的方法能够帮助揭示各种复杂发育过程中涉及的关键机制，在细胞治疗和组织重构方面具有巨大潜力。为了考察APCL策略操纵细胞-细胞相互作用的潜力，作者将不表达叶酸（FA）的HL60细胞与高表达FA的Hela细胞进行混合，并在HL60细胞上共价修饰FA以触发细胞间的组装。此外，作者还对细胞同时进行了BP、DP和TP多重标记，在HL60 、Jurkat T和Hela混合细胞体系中实现了对细胞的招募及示踪。

图5. APCL编程细胞相互作用。

如图5B所示，APCL（DP）标记后可观测到HL60与Hela细胞相互靠近，表明HL60细胞上修饰的FA分子在结合亲和力的作用下拉近了两种细胞的距离，改变了细胞相互之间的作用。另外，在由HL60、Jurkat T以及Hela细胞构成的混合体系中，可观测到大量靶细胞HL60被Hela细胞招募至粘附层（5D-E）。

4. 细胞膜上选择性糖基化修饰

在哺乳动物中，细胞膜上存在大量多糖修饰的生物大分子，包括糖蛋白、糖脂等。这些糖类不仅会影响修饰蛋白及脂类的结构、性质和功能等，还会影响细胞与外部环境的相互作用。基于此，作者基于APCL构建了一种新的活细胞糖基化修饰策略，实现了细胞膜快速的多糖修饰及重构。该体系中，作者采用乳糖酚（LP）和CHO-LP（LP中C6位的羟基氧变为醛基）作为底物进行标记，并通过正交反应对标记分子进行可视化。

图6. 基于APCL的活细胞糖基化修饰。

如图6B所示，只有当HRP、CHO-LP同时存在时细胞表面有明显的荧光信号，表明CHO-LP已成功附着于细胞膜上，而非靶细胞Jurkat T未见荧光信号，表明该策略具有良好的细胞特异性。当将CHO-LP替换成LP后，新引入的糖位点能够被半乳糖氧化酶（GAO）原位识别，出现明显的荧光信号（图6C-D）。同样在混合细胞悬液中，CHO-LP和LP标记均表现出良好的细胞特异性（图6E）。

综上所诉，作者构建了一种新的共价标记策略APLC，能够选择性的编程细胞表面的功能分子，并在复杂细胞体系中执行多种“任务”。文章首次提出了一种在活细胞表面非经典位点上快速引入糖基化的修饰策略，有望在免疫治疗、组织工程及干细胞归巢等领域发挥重要作用。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.2c11150