Nat Commun | 应激诱导胞内RNA G-四链体的折叠
大家好，今天分享的文献是2023年1月发表在Nature Communications上的“Stress promotes RNA G-quadruplex folding in human cells”。通讯作者是来自耶鲁大学医学院的郭俊杰教授和哈佛大学医学院的Pavel Ivanov教授。郭俊杰教授的研究方向是开发和应用新工具来研究神经系统中的mRNA翻译控制和其他转录后基因调控机制，Pavel Ivanov 教授的研究方向是RNA颗粒，tRNA生物学，ncRNA以及基因表达的转录后调控。
研究背景
关于人类转录组的计算分析和高通量实验结果表明，mRNA中存在着数千个RNA G-四链体（rG4）形成位点。这些rG4序列在mRNA的5′和3′非翻译区（UTRs）中普遍存在，表明rG4在mRNA成熟、转运和翻译等过程中具有潜在的调节作用。此外，最近的研究发现包括rG4s在内的RNA二级结构可以作为种子组装RNA结合蛋白，最终生成核糖核蛋白颗粒。
虽然诸多证据支持rG4序列在生理过程中的调控作用，但对于它们在细胞内是作为单链RNA基序还是作为折叠的rG4结构一直存在争议。rG4结构检测方法之一是使用硫酸二甲酯（DMS）将鸟嘌呤G的N7甲基化。N7参与G-四分体的 Hoogsteen碱基配对，不被DMS甲基化。对于单链RNA，N7被甲基化的G不能参与rG4结构的形成，从而缓解rG4导致的逆转录停滞（RT-stop）。而在本篇文章中，作者在DMS鉴定原理的基础上将其设计开发为一种探针从细胞转录组中提取rG4，同时，对rG4在转录后过程中潜在的调控作用展开研究。
结果与讨论
1）应激条件下人体细胞内rG4折叠程度提高
为了检测rG4折叠是否受细胞应激调节，作者将人骨肉瘤（U2OS）细胞固定，用G4特异性抗体（BG4）检测，其主要表现为高水平的核染色和相对低水平的细胞质染色（图1b）。U2OS细胞在饥饿培养基（HBSS）中培养2 h后，胞质中BG4信号强度显著增加，细胞核中BG4信号强度不明显，表明饥饿刺激导致细胞质rG4s折叠增多。为了测试其他细胞应激是否也能诱导rG4折叠，作者用100 μM亚砷酸钠处理U2OS细胞1 h诱导氧化应激，观察到细胞质中BG4信号强度增加约2倍。可稳定rG4的配体carboxy-pyridostatin（cPDS）和pyridostatin （PDS）也增强BG4信号（图1b-c）。
细胞质中的BG4信号对DNase I处理无响应，而对RNase A处理敏感（图1d）。相比之下，以RNA非折叠区域的鸟嘌呤为靶标的RNase T1对降低BG4信号的影响最小，进一步表明应激诱导下细胞质中BG4信号的增加是由rG4折叠引起。
图 1. 应激诱导U2OS细胞质中RNA G-四链体折叠的增强
由于BG4曾被报道在较小程度上与非G4 序列发生交叉反应，因此作者还使用了两种方法来评估BG4信号是否源于细胞中折叠的rG4s。首先，他们用G4特异性的QUMA-1染料对细胞进行染色，观测到细胞质中QUMA-1信号对RNase A敏感，而对DNase I无响应（图1e）。另外，作者利用血红素（Hemin）结合G4s的固有过氧化物酶样活性，进一步证实了rG4s在人体细胞中的应激反应性质。当过氧化物致敏时，rG4-Hemin复合物可引起自我生物素化。作者用血红素、生物素-酪胺和H2O2处理U2OS细胞，并使用链霉亲和素（SA）抗体定量生物素化水平（图1g），在饥饿的细胞中观察到生物素化信号增加，证实了应激诱导的rG4折叠。
2）DMS探测法鉴定应激诱导形成的rG4
为了系统地研究U2OS细胞在应激下折叠的rG4，首先使用RT-stop分析法来识别转录组中的内源性rG4区域。在引物扩增过程中，rG4以K+依赖的方式导致RT停滞，生成可高通量测序的截断cDNA片段。鸟嘌呤位置观察到强烈的RT停滞（比同一转录物内的平均RT停止计数高出10倍）（图2b），表明rG4s是RT的主要屏障。与先前的研究结果一致，发现rG4区域在3′-UTRs中显著富集（图2c）。接下来，利用DMS探针在体内和体外定量了这些内源性rG4区域的折叠状态。mRNA在150 mM K+存在下折叠和DMS修饰后，比在150 mM Li+存在下折叠和DMS修饰后的RT停止平均强1.6倍（图2d）。在1346个rG4区域中，335个（约25%）在K+和Li+条件下的DMS可达性差异为2倍（图2d，黑色），作者将其用于体内DMS探测分析。
图 2. DMS探测法显示mRNA rG4在体内应激下被折叠
为了量化rG4在人体细胞内的折叠，作者在基础或饥饿条件下对U2OS细胞进行了DMS探测，并计算了196个rG4区域在两种条件下的折叠评分。与之前的结果一致，在体内非应激细胞中的绝大多数rG4区域对DMS修饰具有高度可达性，按折叠系数评分，得分中位数为-0.01，表明它们处于以展开为主的稳定状态。同时，饥饿后DMS修饰对rG4区域有很强的保护作用，导致rG4折叠得分中位数为0.64（图2e）。饥饿诱导的rG4折叠普遍存在，72%的rG4显示折叠评分增加了0.25（图2f）。值得注意的是，含有饥饿诱导rG4s折叠的mRNA，在编码RNA结合蛋白、泛素连接酶、细胞质蛋白和膜蛋白的mRNA中富集（图2g）。总的来说，饥饿诱导了rG4结构的普遍和稳定折叠，提高了它们以应激依赖的方式调节mRNA代谢的可能性。
3）对选定mRNA形成的rG4进行体外验证
为了验证DMS鉴定的mRNA 3′-UTR鸟嘌呤富集区折叠成rG4s的能力，作者分析了在K+或Li+条件下，被鉴定为形成rG4的mRNA的圆二色性（CD）谱图特征。在K+条件下，所有被测试的候选rG4s都显示出预期的CD特征（(图3）。此外，作者通过使用G4特异性染料N-甲基吗啡啉 （NMM）验证了它们的G4形成能力，NMM选择性地结合平行G4s，并可以检测丙烯酰胺凝胶中的rG4s。
图 3. 体内实验选定mRNA形成rG4的体外CD谱图特征
4）将生物素化NMM作为捕获胞内rG4s的工具
为了验证DMS鉴定识别的折叠rG4候选物，作者开发了一种可以从细胞裂解物中捕获折叠rG4的探针。由于NMM优先与平行G4s结合，作者推断生物素修饰NMM可作为一种简易分子工具，从总RNA中选择性捕获平行rG4。NMM的两种生物素化衍生物(bNMM)，包括单生物素化NMM（b1NMM）和双生物素化NMM (b2NMM)，具有18个原子长的连接体，以提供足够的空间与长链RNA分子相互作用（图4a）。
为了测试生物素化衍生物是否会影响NMM识别rG4s的能力，作者首先比较了它们与5′ tiRNAala rG4s结合时的荧光变化效应（这些rG4s之前曾被用作研究rG4-NMM相互作用的基准）。b2NMM与未生物素化的NMM表现出相似的荧光行为(图4c)，在凝胶染色中对rG4识别的选择性二者也相当(图4b)，被选择用于进一步实验。
mRNA寡核苷酸在K+或Li+条件下折叠，并可以与链霉亲和素-琼脂糖结合的bNMM平衡。将结合的RNA洗脱后定量，发现在K+条件下bNMM 捕获寡核苷酸显著富集，验证了链霉亲和素结合的bNMM珠对捕获rG4s的选择性（图4d）。接下来，作者使用这种方法从有或没有DMS处理的应激和非应激细胞中捕获了含有rG4的mRNA，定量分析结果显示从应激细胞中回收的RNA数量更高，这与饥饿条件促进细胞rG4s折叠的发现一致(图4e)。
图 4. 生物素化NMM作为选择性探针捕获胞内rG4s
5）3′-UTR rG4应激下的折叠可提升mRNA整体稳定性
由于已知3'-UTR结构元件可调节mRNA的衰变，作者假设折叠的3'-UTR rG4s可能调节这些转录本在应激下的稳定性。作者用放线菌素D（ActD，一种RNA聚合酶II抑制剂）处理细胞，在不同时间间隔内收集RNA。作者观察到，含有3'-UTR rG4的mRNA (APP、APH1A、HIRA和LMNB1 mRNA)在应激下具有明显较长的半衰期(图5a)。相比之下，对照组RNA (β-actin和rRNA 18S)没有观察到这种差异。此外，作者还发现与饥饿细胞相比，cPDS和BRACO-19（一种G4配体）处理的细胞在mRNA化学稳定性方面表现出类似的影响(图5b)。总的来说， 3′-UTR rG4在应激下的折叠有助于增加相应mRNA的化学稳定性。
图 5. 3′-UTR rG4折叠增强了应激下mRNA的稳定性
6）应激诱导rG4折叠的可逆性
可逆性是细胞应激反应机制的主要特征之一。在应激解决过程中无法逆转应激诱导的变化则会扰乱细胞生理过程并导致疾病。当在体外折叠时，许多rG4s表现出异常稳定的结构，可以抵抗高温，这就引出了一个问题，即当细胞不再处于应激状态时，rG4s在体内的折叠是否可以逆转。为了回答这个问题，作者在不同时间点将饥饿介质替换为完整介质，并分析了相对rG4折叠情况。观察到细胞内升高的rG4信号逐渐下降，并在应激解除后1小时内最终恢复到基础水平(图5c, d)，说明rG4在体内折叠是动态的，细胞应激可逆调控。为了评估应激诱导的rG4s在去除应激处理后的展开动力学是否可以被rG4特异性配体调节，作者用cPDS处理恢复细胞，这延迟了恢复细胞中细胞质rG4s的展开(图5c, d)。此外，通过抑制糖酵解(2-DG)或氧化磷酸化(CCCP)降低细胞ATP水平也阻碍了rG4在饥饿去除后的展开(图5c, d)。这表明应激诱导的rG4s的动态展开是一个依赖于ATP的过程。
总结与讨论
作者发现人细胞的应激包括氧化、冷休克和饥饿应激均可诱导细胞内rG4折叠，开发了一种小分子探针来选择性地从细胞转录组中提取rG4并对应激诱导的rG4进行验证，还发现含有3′-UTR rG4结构的mRNA更稳定。最后，尽管细胞对环境压力的反应方式多种多样，但这些应激诱导的变化在应激缓解或适应后是可逆的。
