SCIENCE丨细菌需要相分离才能适应哺乳动物肠道

大家好，今天分享一篇近期发表在Science上的文章，题目是Bacteria require phase separation for fitness in the mammalian gut。本文的通讯作者是来自耶鲁大学医学院的Eduardo A. Groisman教授，他的主要研究方向包括1）细菌如何将多个信号整合到细胞反应中，2）给定信号从共同调节的目标引起不同响应的机制，3）来自肠道微生物组的细菌如何竞争资源和毒力因子的遗传控制。

背景介绍

肠道微生物群在人类健康中起着至关重要的作用，一些菌种促进健康，而另一些菌种则导致各种疾病。操纵肠道微生物群具有良好的临床前景，但需要识别使有益细菌在肠道中定植的因素和机制。多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）是人类肠道中最丰富的细菌种类之一，与瘦且健康的个体有关，目前被作为胃肠道疾病的生物治疗药物进行临床试验。液-液相分离（liquid-liquid phase separation，LLPS)是一种由生物大分子之间通过静电相互作用产生凝聚的现象。这些凝聚物使细胞能够在不同的无膜亚细胞隔间中执行与RNA调控相关的生理过程。Rho是一种ATP依赖的RNA解旋酶，在革兰氏阴性菌中是必需的。Rho通过终止基因末端或mRNA前导体内的转录来控制基因表达，从而根据特定信号改变下游区域的RNA丰度。

首先，作者发现多形拟杆菌Rho比大肠杆菌Rho在RNA结合区域的N端多了一个内在紊乱区域（intrinsically disordered region，IDR），并通过AlphaFold预测了多形拟杆菌和大肠杆菌Rho的蛋白结构（图1A-B）。通过与其他几种细菌的Rho比较，发现这一结构域是多形拟杆菌在进化中独立获得的。为了研究Rho IDR本身在多形拟杆菌中的生理学作用，作者设计了表达WT和缺失IDR（ΔIDR）的Rho菌株，两种菌株在实验室条件下都可以存活。然而，ΔIDR菌株在无菌小鼠的肠道中很容易被WT菌株击败（图1C）。结果表明，多形拟杆菌需要Rho IDR来适应哺乳动物的肠道。此外，ΔIDR菌株也在前无菌小鼠中被WT菌株击败，这些小鼠具有一个复杂的细菌群落，包括13种代表人类肠道主要门的细菌（图1D）。综上所述，这些结果证明了Rho的IDR区域对小鼠肠道中多形拟杆菌的适应度至关重要。

图1 多形拟杆菌的Rho包含IDR，与小鼠肠道健康相关。

IDR促进体外Rho相分离

为了研究IDR如何促进多形拟杆菌肠道定植，作者研究了Rho是否相分离。差分干涉对比（DIC）显微镜显示，浓度低至1.25 μM 的WT Rho在150 mM KCl形成液滴，然而ΔIDR Rho在浓度高至20 μM的条件下也未观测到液滴（图2A）。Rho在细胞内的浓度约为1μM，即体外LLPS发生在生理蛋白和盐离子浓度下。添加RNA总提取物后，WT Rho会产生更丰富的液滴，但对ΔIDR Rho蛋白无影响（图2B）。WT Rho形成的液滴能够发生融合（图2C），荧光漂白（FRAP）实验结果显示荧光恢复速度较缓慢（图2E-F）。此外，低RNA:Rho比例促进液滴的形成，而高比例则阻碍液滴的形成（图2G），相比之下，由IDR形成的液滴在高RNA浓度时显著增加，而与蛋白质浓度无关。

图2 Rho在体外表现出IDR依赖的相分离。

IDR促进体内Rho相分离

作者进一步研究碳饥饿条件下，IDR在体内促进Rho LLPS的能力，这是一种诱导或激活肠道定植所需的转录因子或碳补充的条件。免疫荧光显示，HA标记的WT Rho和ΔIDR Rho定位于整个细胞质（图3A）。然而，WT Rho表现出斑片状分散，形成簇，在碳饥饿条件下增加，LLPS抑制剂1,6-己二醇处理后消失；而ΔIDR Rho在所有条件下均匀分布（图3A）。Rho在小鼠肠道中相分离，从无菌小鼠的盲肠内容物中收获的细菌中观察到明显的病灶，低温电子断层扫描（cryo-ET）显示WT中高密度圆形斑片状分散（图3B）。利用免疫荧光信号的离散度对Rho聚集进行定量分析显示，当细菌在葡萄糖中生长、碳饥饿条件下或从小鼠肠道中收获时，WT Rho的聚类性显著高于ΔIDR Rho（图3C-D）。转录因子BT4338作为阴性对照，它缺乏IDR，不会表现出LLPS，与ΔIDR Rho类似。上述结果表明，Rho在多形拟杆菌中以IDR依赖的方式形成聚合物，并且在碳饥饿和小鼠肠道中，聚合物的数量增加。

图3 Rho在体内表现出IDR依赖的相分离

IDR依赖的相分离支配Rho的转录终止

作者设计了体外转录终止实验，以确定LLPS是否影响Rho依赖的转录终止效率和/或特异性，以及IDR是否在非LLPS条件下修饰Rho依赖的转录终止。最初，作者使用沙门氏菌mgtA先导物作为模板，因为它有一个已建立的Rho依赖的终止子，mgtA RNA在体外不促进Rho LLPS（图4A）。作者使用促进LLPS的盐浓度（100 mM KCl）和不促进LLPS的盐浓度（200 mM KCl）进行了实验（图4B）。在LLPS促进条件下，WT Rho在mgtA前导子中的转录终止活性明显高于ΔIDR Rho（图4C-D）。相比之下，WT和ΔIDR Rho在非LLPS条件下表现出类似的低转录终止活性（图4C-D）。对照实验显示，Rho特异性抑制剂双环霉素（BIC）在LLPS和非LLPS条件下都能阻止WT和ΔIDR Rho依赖的转录终止（图4C-D）。这些结果表明，在低盐培养基中，相对于ΔIDR衍生物，多形拟杆菌Rho在不同模板上表现出的较高的转录终止可能是由LLPS导致的。为了进一步探索LLPS在Rho依赖性转录终止中的作用，作者使用了roc作为模板，在体内进行BIC处理后，roc mRNA的数量增加了~10倍，且roc RNA在体外促进了Rho LLPS（图4A）。在LLPS促进条件下，WT Rho高效产生了多个终止产物（图4E-F），这是Rho依赖的典型终止产物，而ΔIDR Rho表现出最小的终止活性（图4E-F）。BIC抑制了终止产物的出现（图4E-F）。在非LLPS条件下，两种Rho蛋白均未检测到终止产物（图4E-F）。因此，roc模板的有效终止需要WT Rho IDR依赖的LLPS。

接下来，作者研究了LLPS如何影响WT和ΔIDR Rho蛋白在工程模板上的转录终止，该模板由5′端roc序列和3′端mgtA序列组成（图4G）。该模板包含在非LLPS下被Rho终止的位点，并可引发LLPS（图4A）。在LLPS促进条件下，WT Rho主要在roc内促进终止，而ΔIDR Rho主要在mgtA内促进终止（图4G-H）。在非LLPS条件下，WT和ΔIDR Rho仅促进了mgtA内的终止，这在roc-mgtA模板中高于mgtA模板（图4G-H）。在非LLPS条件下，IDR本身似乎对Rho的终止活性没有贡献，因为WT和ΔIDR Rho在这些条件下表现出类似的终止活性（图4G-H）。综上所述，LLPS增加了WT Rho的转录终止活性，并且某些RNA（如roc）主要在LLPS促进条件下终止转录。

图4 IDR依赖的LLPS对Rho转录终止的控制。

中枢代谢基因在肠道中显示出IDR依赖性的表达

为了了解LLPS对Rho转录终止的控制如何影响多形拟杆菌，作者测定了表达WT Rho或ΔIDR Rho的等基因小鼠盲肠内容物中的细菌mRNA丰度。两种菌株有~400个基因的mRNA丰度不同：ΔIDR Rho菌株与WT菌株相比，前者有208个基因的数量减少了两倍以上和185个基因的数量增加了两倍以上（图5）。在ΔIDR菌株中，许多参与中枢细胞通路的基因，包括氨基酸和小分子生物合成、tRNA加工、蛋白质翻译和折叠等基因，均被下调，而与转录和双组分系统信号转导相关的基因则被上调（图5B）。重要的是，一些IDR调控的基因是肠道中细菌适应性所必需的，包括那些参与获得必需维生素B12的基因，这些微量元素无法合成只能从宿主饮食中获得。KEGG通路富集分析显示，ΔIDR Rho菌株参与氨基酸、核苷酸和次级代谢产物翻译和生物合成途径的基因mRNA丰度较低，但参与有氧呼吸的基因mRNA丰度高于WT菌株（图5C-D）。因此，Rho IDR控制着许多关键基因的表达，这些基因是肠道健康所必需的。

图5 拟杆菌在小鼠肠道中表现出IDR依赖的基因表达。

总结

作者揭示了Rho IDR依赖的相分离可以作为一种多形拟杆菌在哺乳动物肠道中定植的新型分子机制。通过触发Rho LLPS增加Rho终止活性，改变多种基因的表达。该研究确立了LLPS在宿主-共生细菌相互作用中的关键地位，扩大了LLPS对细菌生理学的重要性，并确定了肠道微生物群操纵的新靶点。

原文链接：Bacteria require phase separation for fitness in the mammalian gut | Science