Nat Chem Biol丨通过直接招募26S蛋白酶体进行靶向降解

本次给大家分享的是发表在Nature Chemical Biology上的一篇文章，题目是Targeted degradation via direct 26S proteasome recruitment。

作者介绍

文章的通讯作者均来自于美国基因泰克公司。

 ①Ingrid Wertz是Genentech肿瘤学和生物化学部门的首席科学家，主要负责利用人体内自然存在的蛋白降解系统，为有需要的患者开发基于蛋白质的新型降解药物。

②Claudio Ciferrii是结构生物学家，主要擅长膜蛋白复合物、受体-配体相互作用以及多蛋白复合物等在疾病领域的结构生物学研究。

③Erin C. Dueber是生物物理学家，主要聚焦于DNA复制启动过程中DNA-蛋白质复合物的X射线晶体学。

背景介绍

PROTAC技术是由Craig Crews在2001年提出的概念，这个概念一经提出便引来了许多研究者的关注，并且由其创立的Arvinas公司所开发的两个PROTAC分子——ARV-110和ARV-471，靶向降解雄激素和雌激素以分别治疗前列腺癌和晚期/转移性乳腺癌，是最早进入临床试验的一批PROTAC药物。这表明蛋白降解剂这种治疗模式已经成为了一种十分有潜力的靶向治疗手段。但是实现这一降解过程的关键部位——E3泛素连接酶在各细胞中表达各异，并且可用的E3泛素连接酶种类目前也较少，因此想要通过PROTAC技术来实现有效的靶蛋白降解仍然充满挑战。

图1  PROTAC技术和直接靶向蛋白酶体技术的比较

而在篇文章中，作者在PROTAC原理的基础上，提出了一种直接将底物引向26s蛋白酶体的降解策略，即找到一个合适的26S蛋白酶体的配体并将其与靶蛋白配体连接在一起形成降解化学诱导物（chemical inducers of degradation, CIDE），从而实现将靶蛋白与蛋白酶体连接在一起继而进行降解。由于26s蛋白酶体在所有细胞中都能高表达，所以通过该策略能够跳过泛素化这一过程，并且消除由E3泛素连接酶所带来的局限性。同时也不要求靶蛋白拥有可泛素化赖氨酸，理论上可以扩展到任何底物；此外，这种策略使得降解端只需一种配体就足够通用。机体本身也天然存在一些不依赖泛素化而直接被蛋白酶体降解的蛋白，如鸟氨酸脱羧酶和胸苷酸合酶。（二者对比如图1）

图2 蛋白酶体结构

蛋白酶体（图2）是由核心(core)颗粒和调节(regulatory)颗粒组成，调节颗粒又可分为组装过程相对独立的两个亚复合物，分别称为“基座”(base)和“盖”(lid)。调节颗粒的功能至关重要，可以控制一系列酶的活性，同时负责识别、支架、通道和组装的亚基等功能，其结构也相对更复杂。【PENG, Sun, et al. Progress in Study of Clarifying The Structure and The Mechanisms That Regulate The Activity of The Proteasome. PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, 2015, 42.12: 1084-1093.】  然而，目前针对26S蛋白酶体亚基的选择性配体种类较少，且无法保证配体的结合部位不会影响到26S蛋白酶体的功能，因而限制了降解化学诱导物CIDE的有效开发。

26S蛋白亚基 PSMD2 配体的发现

图3 从 Display中发现的配体

因此，作者首先尝试筛选寻找到合适的蛋白酶体配体。如图3所示，作者针对26S蛋白酶体的一个亚基——PSMD2（“基座”的组分之一，其功能是作为泛素或者泛素样蛋白(UBL)的受体，此外也介导一些其他蛋白同蛋白酶体的互作，比如去泛素化酶USP14） 分别通过噬菌体展示技术（图3a）和mRNA 展示技术（图3b）从8-16氨基酸长肽噬菌体库和10-14个残基的大环mRNA库中筛选得到了一系列对26s蛋白酶体亚基PSMD2具有较好亲和力的配体，得到了四个纳摩尔级别结合强度的配体，包括三个大环肽MC1、MC2、MC3以及只含有标准氨基酸的线性寡肽pp1，后续也证明了三个配体能够结合完整的26S蛋白酶体，说明结合部位不会被复合物组装所影响。

作者在mRNA display过程中使用了经过改编的密码子（图3c），从而引入了非标准氨基酸ClAcF（氯乙酰苯丙氨酸）作为起始氨基酸。之所以引入非标准氨基酸一方面是为了拓宽筛选文库，另一方面则是为了通过标准FMOC固相法来将第一位中的苯丙氨酸与倒数第二位的半胱氨酸形成硫醚键并形成环肽，从而获得性能更加优越的PSMD2配体。   

大环化现在是一种常见的配体优化策略。从理论上解释，线性寡肽在水溶液中构象变化的自由度很大，以高度无序（高熵）的状态而存在；而环肽的构象变化受限，降低了结合时的自由能。另外，大环肽穿膜性、稳定性也均比线性肽更优。

26S蛋白亚基 PSMD2 配体的发现

图4 验证配体与PSMD2的结合

免疫共沉淀实验（图4），结果表明PP1、MC1以及MC2无论是对PSMD2还是完整的26S蛋白酶体都具有一定的结合能力。而MC3虽然能够与PSMD2结合，但却无法与完整的26S蛋白酶体进行结合，这也就表明当PSMD2形成完整的26S蛋白酶体后，其与MC3的结合位点被掩盖，从而导致MC3无法与26S蛋白酶体结合。

图5 体外翻译和ELISA实验

排除MC3后，对于剩下的两个环肽MC1和MC2，作者进行了赖氨酸和丙氨酸扫描（图5），将MC1和MC2中的氨基酸进行逐个突变，并通过ELISA最终发现这两个环肽配体与PSMD2结合的关键残基为HRYxGW/F基序。并且将半胱氨酸突变为丝氨酸会导致环肽无法形成，从而使其无法与26S蛋白酶体结合，表明肽链的环化对这两个配体能否与蛋白酶体结合是必不可少的。

PSMD2 的结构揭示新的配体结合位点

图6 单粒子冷冻电镜技术测定

图7 MC1结合不影响PSMD2结构

为了能够更加直观的阐明PSMD2与大环肽相互作用的分子基础，作者还采用了单粒子冷冻电镜技术来测定了MC1-PSMD2复合物以及MC1-蛋白酶体复合物的结构（图6），并对其结合位点和方式进行了描述。图中表明MC1结合在PSMD2的C端结构域和螺旋螺线管之间。此外，结合口袋的分析也表明MC1使用HRYxGW基序来与PSMD2结合，与之前所得的实验结果一致。并且通过实验（图7），作者还发现MC1与PSMD2的结合并不会改变PSMD2的结构，也就表明这种结合口袋是预先形成的，而不是由配体结合诱导所产生。

大环衍生的CIDEs结合PSMD2和BRD4

图8 BRD4结构

图9 CIDEs结构

接下来作者选用了癌症中常见的BRD4靶点进行实验验证，BRD4（图8）属于溴结构域及末端外(Bromodomain and ExtraTerminal, BET)蛋白家族，溴结构域(bromodomain)这一名称最初来源于果蝇的一个与生长发育/表观遗传调控相关的基因Brahma/Brm而实际上与溴(bromine)无关。

溴结构域能够识别靶蛋白（例如组蛋白）上的乙酰化赖氨酸残基，且乙酰基越多结合力越强。许多BET抑制剂(BETi)就是模拟乙酰基的结构使BET蛋白与其错误结合而实现抑制效果。BRD4在生长发育和多种癌症发生发展中起重要作用，例如有报道指出BRD4抑制会导致胚胎干细胞的分化并损害其多能性。

为了对26s蛋白酶体直接降解靶蛋白的概念进行验证，作者选用BETi24作为BRD4蛋白的配体。然后，为了将两个配体进行连接形成CIDE（图9），作者采用了P4、P6、C7P6以及P4P6作为连接子（其中P代表聚乙二醇，C7代表-(CH2)7-CONH-），并且考虑到连接子与配体的连接位点往往会是CIDE的优化参数，所以对于MC1作者选择了四个不同的位点（G15、V4、L7、W10）作为连接子的连接位点，最终经过排列组合得到了16种不同结构的CIDE分子。

图10 alpha screen和NanoBRET实验

紧接着作者便通过alpha screen和NanoBRET（图10）分别对这些CIDE分子在细胞中的26s蛋白酶体结合能力以及BRD4蛋白结合能力进行了测定，结果如图，通过alpha screen证明了这些CIDEs仍然能与26s蛋白酶体结合（图c），并且在表达纳米BRD4-纳米荧光素酶的通透细胞中这些CIDEs也仍然可以和BRD4蛋白结合（图d）。此外，通过亲和纯化也表明这些CIDEs能够成功地介导PSMD2-BRD4BD1的形成（图10 右侧）。

评估基于大环肽的CIDE的潜在渗透性

图11 MC1 被传递到细胞质和核内体

为了评估基于大环肽的CIDE的潜在渗透性，作者将荧光染料Cyanine5.5偶联到MC1 4号位缬氨酸上，并通过荧光显微镜监测了细胞的摄取。如图，在大约2.5min后，细胞质中就可检测到荧光信号，且强度随时间的增加而增加，并且之后核内体（endosomes）中的荧光信号也随之增强，由此可见MC1有着较好的细胞渗透性（图11）。

PSMD2-BRD4 CIDEs在细胞中介导BRD4的降解

图12 基于PSMD2的CIDEs介导HEK293细胞中BRD4的降解

基于以上实验，作者最终筛选出了一个性能较好的分子BetCIDE V4-P6（L-CIDE），并进一步评估了其与26s蛋白酶体、BRD4的结合能力以及对细胞中BRD4蛋白的降解能力。如图，在HEK293细胞中，尽管在没有加入细胞渗透剂digitonin的情况下，L-CIDE依旧显示出了一定程度的细胞渗透性，并能够与细胞中的BRD4蛋白结合（图12左），为了进一步评估这些分子的降解活性，作者在HEK293细胞中使用了之前报道的PROTAC分子MZ1（ACS chemical biology. 2015;10(8):1770-1777）来与L-CIDE进行对照，并通过免疫荧光法对BRD4的降解情况进行了监测（图12右上）。如图，虽然L-CIDE的降解效果不如MZ1，但实验数据表明L-CIDE介导的BRD4降解也具有剂量依赖性，其DC50为0.73μM。

图13  Western Blot 实验

 Western blot的结果也显示出L-CIDE对BRD4L和BRD4S具有一定的降解作用（图13d）。此外，作者在进行这些实验时还使用了L-CIDE的对映异构体D-CIDE（把L-CIDE中的L构型氨基酸替换为D构型氨基酸）来进行对照，结果表明D-CIDE虽然能与BRD4蛋白结合，但却无法与26S蛋白酶体结合，从而导致D-CIDE最后也无法诱导BRD4蛋白的降解，并且当加入蛋白酶体抑制剂Brz后（图13e），L-CIDE的降解能力消失。因此，综上也就表明L-CIDE的降解过程与预想的一致，是通过蛋白酶体实现的。

总结

在这篇文章中，作者通过mRNA 展示技术筛选出了针对26s蛋白酶体亚基PSMD2的高亲和力配体MC1，并将其与BRD4配体连接在一起，成功设计出了一个能够直接通过26s蛋白酶体来实现靶蛋白降解的降解化学诱导物（CIDE），从而对文章中提出的“通过直接招募26S蛋白酶体以降解靶蛋白”这个概念实现了验证。这也为靶蛋白降解提出了一种新的策略。