JACS丨随机序列库中的Toehold介导的链迁移

大家好，今天分享一篇2023年发表在JACS上的一篇题为《Toehold-Mediated Strand Displacement in Random Sequence Pools》的文章。本文的通讯作者是来自德国慕尼黑工业大学的Friedrich C. Simmel教授。Simmel教授长期从事人工分子机器、DNA纳米结构、人工生物电路的设计等方面的研究。

本文中重点探究了复杂核酸背景下的非特异性链置换反应。Toehold介导的链置换反应（TMSD）被广泛用于体外传感，目前也越来越多地用于细胞计算和基因调控。然而在大型体外DNA或RNA计算网络、DNA存储、生物传感和胞内链置换反应等应用当中不可避免地存在大量的背景干扰序列，这些背景序列往往会对链置换反应动力学产生影响。尽管Multistrand，KinDa和OxDNA等工具可以对于比较简单的体系进行动力学建模和分析，然而却缺乏适用于存在背景序列的复杂系统的研究工具。因此本文使用了具有已知长度和浓度的随机序列的单链DNA池对复杂核酸背景下的相互作用进行研究，以期更好地预测复杂背景下的链置换动力学行为。作者首先使用了高浓度的50nt长度的随机ssDNA背景链探究了对TMSD动力学的影响。在没有随机池的情况下链置换反应在几分钟内可以完成，然而在背景序列存在的情况下，随机序列会结合到反应元件上，从而减缓反应发生（图1）。

图1. 背景序列影响下的链置换反应

随后，作者探讨了单个干扰序列对链置换反应动力学的影响因素。作者认为，干扰序列对电路动力学行为影响的主要因素在于其与输入链形成了部分互补的双链复合体，因此后续研究工作主要聚焦在随机序列池与输入链之间的相互作用。作者使用了总共约300条35nt的随机序列，然后分别将这些随机序列于输入链进行预平衡，然后再启动反应。获取了这300个干扰链的动力学数据后，通过与可解释的结构特征数据集相结合，得到了性能较为理想的如图2所示的简单的回归树模型。该模型提取到的参数主要有三个：（1）输入序列的立足点游离碱基总数目；（2）输入链和干扰序列的双链结构自由能；（3）输入序列的立足点最长连续游离碱基的数目。在大多数测试案例下，简单的回归树或分析模型就足以粗略估计动力学参数。而对于强结合的干扰链，仅靠立足点游离碱基总数目就可以很好地预测动力学。

图2. 干扰单链DNA对TMSD动力学的影响

随后，作者探讨了不同长度和浓度下的随机序列对TMSD动力学的影响。作者使用长度分别25，50，100和200nt的随机序列探究了其浓度在1μM、10μM、50μM、200μM对立足点长度为10nt和20nt的输入链的TMSD动力学的影响。如图3所示，在较高的随机序列浓度下，反应速率就越低，可能是因为高浓度随机序列能够以较大概率与输入链发生相互作用的结果。此外，不同长度的随机序列也会影响TMSD动力学。而不同立足点长度的输入链在随机序列影响下的动力学变化情况也有所差异，一般而言，影响动力学的最重要因素是封闭立足点的碱基的概率，对于较短的立足点，只需通过封闭少量碱基即可显著降低反应速度，而对于较长的立足点，则需要封闭更多数目的碱基才能显著降低反应速度。

图3. 随机DNA库对TMSD动力学的影响

随后，作者构建了包含100,000条50nt随机链的文库，并按ΔΔG的分布划分为4个区间，其中ΔΔG为前1%的随机链为第一个区间。然后在每个区间抽取了100条链，这400条链的总体ΔΔG和随机链文库是一致的（图4a）。作者认为只有和输入链强结合的随机链才会在动力学占主导地位，因此作者使用了ΔΔG为前1%的100条链作为模拟随机链池进行分析，以期获得一个能根据每条随机链的影响而准确预测总体动力学参数的模型。结果表明随机序列文库和ΔΔG为前1%的100条链的动力学非常相似，证明了随机池中结合最强的随机链在平衡行为中占主导地位。

图4. 随机DNA链库与包含已定义序列的DNA链库(模拟库)的比较

对实际应用而言，更关注的是如何在存在背景序列时仍保持快速和稳健的链置换动力学。可以选用的方法包括有三碱基法则，内部toehold保护(ITP)，外部toehold保护(ETP)。其中三碱基设计原则和内部toehold保护都都导致较小的设计空间。而外部toehold保护法只需要一条额外的Blocking strand就可以避免背景序列库对输入链的干扰，设计空间较大。这三种方法均能够有效改善背景序列对动力学的影响，其中ITP法的效果更为明显（图5）。

图5. 随机DNA链库与包含已定义序列的DNA链库(模拟库)的比较

总结：本文探究了背景核酸序列对toehold介导的链置换反应动力学的影响，探究可能会影响动力学的因素，包括随机链的长度、浓度、立足点长度等。根据少量的结构参数即可在计算机上准确预测动力学参数，此外，作者还探究了包括ETP在内的设计方法对链置换动力学的改善效果，将有效助力于构建对背景噪声具有鲁棒性的TMSD电路。