Nat Commun丨基于DNA折纸结构的核酸适体纳米阵列在血液透析中的有效可逆抗凝效果

大家好，今天为大家分享的文献是2021年1月发表于Nature Communications上的A DNA origami-based aptamer nanoarray for potent and reversible anticoagulation in hemodialysis。

背景图&图1 装载有核酸适配体的DNA折纸纳米阵列用于血液透析抗凝治疗中的设计

作者介绍

本文的通讯作者为国家纳米中心的丁宝全教授与蒋乔研究员。丁宝全教授课题组致力于开发DNA自组装结构的多个功能基元共组装，以及研发DNA纳米材料的多种功能化修饰，实现共组装DNA纳米材料在活体内的长循环、精准靶向递送效果、疾病组织的有效富集与可控释放。

研究背景

当慢性肾脏病患者到达其病程晚期，其肾功能已近乎完全丧失，为排出体内因肾衰竭而不断累积的代谢废物以及调整体内内环境，患者需在数种肾脏替代疗法进行选择，其中一种便是血液透析。血液透析通过将体内血液引流至体外，经一个由一根根空心纤维组成的透析器中，血液与透析液在空心纤维内外通过弥散、超滤、对流等原理进行物质交换，由此清除体内的代谢废物、维持水电解质和酸碱平衡。然而，在血透的治疗过程中，患者的血液通过外周透析回路的这一过程有激活血小板与凝血级联反应的倾向，因此预防体外循环中的凝血是血透的一大重点。在临床血透过程中常使用诸如肝素等的抗凝药物，但其仍有一系列副作用。此外，临床上使用的抗凝逆转/解毒剂鱼精蛋白，也被证实有毒性，且纠正作用有限。因此，临床上亟需开发有效、且解毒时更为可控的抗凝替代品。凝血酶是凝血系统中的一种重要物质，也是抗凝血药物设计的一个热门靶点，近十年来，得益于SELEX技术，已有多种针对凝血酶的核酸适配体诞生，并可以直接识别和抑制凝血酶。然而，这些适配体的递送以及体内稳定性限制了其在抗凝治疗中的应用。而具有结构可编程性、空间定位性和良好生物相容性的DNA/ RNA纳米技术恰好能填补这一漏洞。本文便是利用一种90x60x2 nm尺寸的长方形DNA折纸结构，装载并保护36对具有抗凝协同作用的核酸适配体，从而在溶液、体外样本、小鼠、血透模拟装置等多种模型中验证其抗凝作用，并通过添加能干扰核酸适配体二级结构的特定核酸序列从而逆转这种抗凝作用（图1）。

研究结果

图2 基于DNA折纸结构的适体纳米阵列的表征

首先，作者们合成并表征了他们所设计的基于DNA折纸结构的核酸适配体纳米阵列（以下简称“适体纳米阵列”）。他们在90 x 60 x 2 nm尺寸的长方形DNA折纸结构上设计了9行4列，共计36对结合位点，并将一对已知与凝血酶结合并抑制的核酸适配体TBA15与HD22通过序列互补连接于其上。琼脂糖凝胶电泳显示合成的每一步条带位置都有所变化，提示适体纳米阵列的成功获得（图2a）。动态光散射、Zeta电位等实验也证实了纳米结构合成前后的差异，其平均直径从63.0±1.2 nm增长到92.2±1.3 nm，Zeta电位也从−12.2±0.8 mV变化至−10.9±1.1 mV（图2b-c）。此外，适体纳米阵列与凝血酶结合后能在AFM图像上观察到明显的亮点，且纳米结构的高度也有所增加（图2d-f）。

图3 基于DNA折纸结构的适体纳米阵列对于凝血的抑制及逆转作用

凝血酶可以将可溶性的纤维蛋白原转化为多聚且不可溶的纤维蛋白单体，并在溶液中造成光散射信号的增强，因此便可以利用这一特性测定溶液中凝血酶的催化活性（图3a）。比起未合成的纳米结构单体，亦或是将TBA15与HD22以polyA相连的方式，将等量的适体以5.4 nm的间距排列在DNA折纸结构上可显著提高对凝血酶性能的抑制（图3b-c）。而在人类血浆中分析活化部分凝血活酶时间（APTT，一种评估凝血酶功能和纤维蛋白凝块形成的临床检验项目）可得，对照组的APTT为24±1.1 s，而适体纳米阵列所致的凝血时间延长最多，为246.7±17.5 s，且在加入5x DNA解毒剂后，92%的抗凝血作用得到逆转（图3d）。而在全血样本中，血栓弹力图，一种评估低剪应力下全血凝块形成的整体粘弹特性指标显示，加入适体纳米阵列后出现第一个血栓凝块的时间显著延长，而在加入解毒剂后，该指标回到与对照组相当的水平，这也提示适体纳米阵列在血浆与全血样本中都能达到预期的抗凝与逆转效果（图3e-f）。

图4 基于DNA折纸结构的适体纳米阵列在小鼠体内的抗凝与中和作用

接着研究者们在小鼠体内验证适体纳米阵列的抗凝作用。向小鼠尾静脉内打入各种类型的核酸纳米结构后，收集小鼠血清并检测APTT，结果显示适体纳米阵列处理组小鼠凝血时间为41.7±2.7 s，较别组显著延长（图4a）。此外，通过建立鼠尾横切出血模型评估小鼠注射核酸纳米结构后15分钟内从尾部流失的血液量，结果显示与对照组和T-16A-H处理组相比，适体纳米阵列（~560 nM, 100L）处理的小鼠有着更为明显的出血倾向（图4b-c）。

图5 基于DNA折纸结构的适体纳米阵列在体外血透模拟装置中对人血的抗凝作用

最后，研究者们通过建立体外血液透析模拟装置，进一步求证适体纳米阵列在临床应用中的可行性（图5a）。在1 h的模拟透析时间内分多个时间节点对循环的人类全血样本进行检测，结果显示，与折纸结构加两个单独的适体组相比，用适体纳米阵列处理的血液样本有着显著更高和更稳定的APTT值（图5b）。此外，透析结束后对透析器表面的扫描电镜结果显示适体纳米阵列的存在有效地防止了透析器内血栓的形成，其中空滤芯内未观察到明显的纤维蛋白或细胞碎片（图5c）。这些结果都再一次证明了研究者们的实验设计在血透模拟装置中的成功性。

研究总结

本文的研究者们设计并合成了一种装载有合适间距的核酸适配体对的DNA纳米结构，其设定间距（5.4 nm）与凝血酶分子的大小（4 nm）相符，并在溶液、血浆、全血、小鼠模型、血透循环装置等多种体内外模型中验证其设计结构的有效可逆抗凝效果。核酸适配体抗凝的想法虽由来已久，但通过利用DNA纳米技术的可编程性与良好空间定位性弥补该领域现有的不足，并且与临床血液透析相结合，是本文的一大亮点。除血透外，如心脏搭桥等等涉及到体外循环的临床手术，都可能遇到凝血级联反应的挑战，因此本文所设计的结构也有更多的临床应用前景。

原文信息

Zhao, S., Tian, R., Wu, J. et al. A DNA origami-based aptamer nanoarray for potent and reversible anticoagulation in hemodialysis. Nat Commun 12, 358 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20638-7