ANGEW丨Aptamer-LYTACs 用于细胞外和膜蛋白的靶向降解
今天给大家分享的是发表在Angew Chem Int Ed Engl 上的一篇文章《Aptamer-LYTACs for Targeted Degradation of Extracellular and Membrane Proteins》，文章的通讯作者是厦门大学化学化工学院的朱志教授。
背景介绍：有关疾病的靶蛋白，传统的治疗策略大多使用小分子抑制剂或单克隆抗体来阻断靶蛋白功能。然而，一些蛋白质缺乏可接近的结合位点，这使得它们无法通过抑制剂方法解决。一种可能的方法是基因治疗，例如基因组编辑和使用反义寡核苷酸分别靶向DNA或信使RNA，以抑制基因转录或翻译为蛋白质，但这些策略非常昂贵，不可预测，并且难以实现。另一种是使用PROTACs技术降解目标蛋白，但其只能用于细胞内蛋白的降解，无法用于细胞膜蛋白。最近，斯坦福大学HHMI研究员Carolyn R. Bertozzi教授团队开发了基于细胞膜表面溶酶体穿梭受体蛋白IGFIIR的LYTACs技术，可以快速高效的降解细胞膜表面蛋白，然而IGFIIR不具备组织特异性，可能会造成一定的毒副作用。为此，为了实现组织特异性LYTAC活性，斯坦福大学的Carolyn Bertozzi课题组报告了基于ASGPR的LYTACs技术，ASGPR是肝脏组织特异性表达的细胞表面溶酶体穿梭受体，可特异性降解肝细胞膜表面的靶标蛋白。本文则是基于此，设计开发了Apt-LYTACs技术，使用tri-GalNAc修饰核酸适配体，同时结合肝脏细胞膜表面的ASGPR和靶标蛋白，实现了细胞外以及细胞膜表面靶标蛋白的快速高效降解。
Apt-LYTACs用于细胞特异性胞外和膜蛋白降解的工作原理
结果与讨论：
去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是一种肝特异性细胞膜溶酶体穿梭受体跨膜糖蛋白，具有肝脏特异性和种属特异性。Apt-LYTACs是修饰有GalNAc的核酸适配体，其中核酸适配体用于识别胞外蛋白或膜蛋白，GalNAc用于特异性识别ASGPR。Apt-LYTACs同时结合ASGPR和靶标蛋白后，通过内吞作用将靶标蛋白拉入溶酶体进行降解。
作者首先合成了一个随机DNA序列（RS），其3’端与生物素偶联，5 ’端与GalNAc偶联，称为GalNAc-RS，同时使用荧光标记的链霉亲和素Streptavidin-Alexa Fluor488 （SA-488） 作为细胞外的模型靶蛋白，最后通过观察细胞内的荧光信号来验证Apt-LYTACs的功能（图1a）。作者选择HepG2细胞（肝癌细胞，膜表面高表达ASGPR）作为阳性细胞，和A375细胞（黑色素瘤细胞，不表达ASGPR）作为阴性细胞，流式结果显示，GalNAc-RS处理组HepG2细胞的荧光增加了8倍， A375细胞没有观察到荧光增加；单独加入SA-488的对照组，HepG2细胞和A375细胞均没有荧光增加，说明SA-488的内化依赖于GalNAc-RS与ASGPR的结合，是细胞特异性的（图1b、c）；同时，作者发现SA-488的细胞内化是时间依赖性的，1h内荧光增加了5倍（图1d、e），并且在处理24h后GalNAc-RS对细胞没有明显的毒性；荧光显微镜图像显示GalNAc-RS处理的HepG2细胞组中，SA-488信号与溶酶体共定位，表明SA-488被运输到了细胞中的酸性区室（图1f）。综上所述，这些数据表明GalNAc-RS可以在ASGPR阳性细胞中迅速将SA-488转运至溶酶体。
图1 GalNAc RS介导细胞特异性内化和SA-488向溶酶体的转运
鉴于GalNAc-RS在模型体系中成功内化SA488，作者将GalNAc-RS替换为GalNAc-Apt以结合特定的靶蛋白并将其递送到溶酶体进行降解（图2a）。为了验证设计的可行性，作者在特异性结合血小板衍生生长因子PDGF-BB（癌症增殖、侵袭和转移的驱动蛋白之一）的核酸适配体上修饰了GalNAc，用NTA-OG488荧光标记含有His-tag的PDGF。与HepG2和A375细胞共孵育两h后，发现与AptPDGF + PDGF488相比，GalNAc-AptPDGF + PDGF488处理后的HepG2细胞中出现了明显的荧光增加，而在A375细胞中均没有没有明显的荧光增强，这表明PDGF488的内化依赖于GalNAc-AptPDGF和ASGPR（图2b）。此外，将GalNAc-AptPDGF与PDGF-488的比例从1:1变为2:1和4:1，并发现1:1比例时PDGF-488内化信号最强（图2c），可能是由于过多的GalNAc-AptPDGF会竞争性结合ASGPR。通过共聚焦显微镜观察，PDGF488荧光信号主要位于在HepG2细胞内，很少与细胞膜染料DiI共定位（图2d）。为了评估PDGF的降解情况，HepG2细胞与GalNAc-AptPDGF + PDGF孵育2 h后，替换为新鲜培养基以去除剩余的PDGF，进一步培养2 h或4 h；Western Blot检测HepG2细胞裂解液中的PDGF，发现在加入新鲜培养基2 h和4 h后，PDGF的量明显下降；其中，4 h后的PDGF量与未处理HepG2细胞中PDGF量基本相等，说明内化的PDGF在4 h内几乎全部降解；而用溶酶体抑制剂巴非霉素A1处理可在每个时间点适度地减弱PDGF的降解（图2e, f）。这些结果表明GalNAc-Apt PDGF可以通过溶酶体降解途径有效降解PDGF。
图2 GalNAc-AptPDGF介导PDGF的细胞特异性内化和降解
基于上述良好的实验结果，作者进一步研究了Apt-LYTACs是否能够介导膜表面蛋白的细胞特异性降解。首先，作者在特异性结合跨膜受体蛋白酪氨酸激酶-7（PTK7，肿瘤细胞高表达，参与调控Wnt信号网络，影响细胞运动、侵袭和转移）的核酸适配体Sgc8c上修饰GalNAc，并使用HepG2细胞为阳性细胞（ASGPR+，PTK7+），SW480细胞为阴性细胞（ASGPR-，PTK7+）；然后，将GalNAc-AptPTK7与HepG2或SW480细胞在37℃下孵育不同时间；最后，通过流式细胞术评估细胞膜表面PTK7的含量。HepG2细胞中PTK7的流式荧光信号呈时间依赖性下降，在24 h荧光信号下降了46%（图3b）。此外，作者发现PTK7的降解效率与GalNAc-AptPTK7的浓度相关，500 nM时降解效果最优，更高浓度下降解率略有下降，可能是由于双功能分子系统中常见的钩效应（图3c）。Western blots检测发现，在HepG2细胞中GalNAc-AptPTK7处理24 h后，对PTK7的总降解量约为30%，与流式细胞术的结果基本一致，而在GalNAc-AptPTK7孵育处理的SW480细胞中，不论是流式细胞术还是Western Blot均未发现PTK7的信号差异（图3d、f）。
作者团队首次证明了基于核酸适配体的LYTACs能够对靶细胞外蛋白和膜蛋白进行细胞特异性降解，核酸适配体与ASGPR以及靶蛋白之间形成三元复合体，随后通过ASGPR介导的溶酶体途径将蛋白质运输到溶酶体，由溶酶体蛋白酶降解。
图3 GalNAc-AptPTK7介导PTK7的细胞特异性降解
