Cell | RNA核酸适体实现靶蛋白的O-乙酰氨基糖基化并揭示其修饰后作用
今天分享一篇发表在Cell上的文章，标题：Dual-specificity RNA aptamers enable manipulation of target-specific O-GlcNAcylation and unveil functions of O-GlcNAc on beta-catenin
通讯作者：
Gerald W. Hart，来自美国约翰霍普金斯大学医学院，研究领域主要是癌症、糖尿病和神经推进性疾病中糖分子的功能性研究。
研究背景：
同泛素化、磷酸化等翻译后修饰一样，O-GlcNAc糖基化修饰对细胞生命活动十分重要，与肿瘤和糖尿病等密切相关。但针对特定蛋白的O-GlcNAc修饰仍然十分困难。本文以双特异性RNA (DS) aptamer为工具，以β-catenin为模型蛋白，成功构建了特定蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰模型，并通过riboswith和Tet-on system实现对DS aptamer的控制。
结果与讨论：
通过SELEX技术获得OGT核酸适体T1，且T1不影响OGT的表达和功能
首先，O-GlcNAc糖基化修饰活动由OGT酶介导；并且OGA酶可使发生O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白的乙酰葡萄糖胺解离下来。作者首先通过SELEX技术，筛选获得可以OGT蛋白结合的RNA核酸适体T1，其与OGT结合的Kd约60 nM（图1）。T1与OGT酶非功能域结合（图1F），且不影响OGT活性（图1G），对OGT自身的表达水平和细胞蛋白总O-GlcNAc糖基化修饰水平均无明显影响（图1I）。T1和OGT的结合严格以来Mg2+（图1H），其在细胞内的半衰期约16 mins。
图1 SELEX获得与与OGT酶非功能域结合的RNA核酸适体
DS aptamers可提高GFP标记蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰水平
作者首先通过linker构建了T1-AP3 DS aptamers（图2A），其中AP3是GFP RNA核酸适体。作者构建了可外源性表达GFP标签的β-catenin蛋白。由于DS aptamers将OGT和带有GFP标签的β-catenin蛋白拉近，因此外源性β-catenin的O-GlcNAc糖基化修饰水平发生上调，而内源性β-catenin的O-GlcNAc糖基化修饰水平无明显变化（图2C，D），且OGT抑制剂Ac5S可抑制O-GlcNAc糖基化修饰（图2F）。
随后作者使用刚性linker代替柔性linker，发现依然可以发挥糖基化修饰作用，但修饰水平随着碱基对的增加而变化：增加的碱基对形成的螺旋改变了T1扭转方向。结果显示增加6 bp时，糖基化修饰效果相对最好（图2J）。
图2 DS aptamers可提高GFP标记蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰水平
O-GlcNAc通过抑制β-catenin与TrCP的结合从而维持β-catenin的稳定性
由于β-catenin不但发生磷酸化、泛素化，然后与TrCP结合，最终处于不断的被降解状态，因而在静息细胞中，β-catenin在细胞内的累积表达量较低。O-GlcNAc修饰后，其磷酸化水平降低（图3D），与TrCP结合减少（图3A），且可被OGT抑制剂抑制（图3E）。
图3 O-GlcNAc通过抑制β-catenin与TrCP的结合从而维持β-catenin的稳定性
O-GlcNAc可实现内源性β-catenin糖基化修饰增加
作者筛选获得β-catenin的RNA核酸适体bc339后，使用柔性linker和刚性linker实现DS aptamers的糖基化修饰功能。当作者将支架linker 3JB8F改为3JB8R+12时，DS aptamer不再能发挥糖基化修饰的作用，证明DS aptamer设计的重要性。
图4 O-GlcNAc可实现内源性β-catenin糖基化修饰增加
O-GlcNAc促进β-catenin与EZH2的相互作用
Wnt通路是细胞在收到外界环境刺激时，细胞膜表面的配体如β-catenin响应刺激，激活wnt信号通路。作者发现，β-catenin与EAH2蛋白的结合增加，且与wnt通路是否被激活无关，这种介个可以被OGT抑制剂抑制。而3JB8R+12不能产生类似的结果。
图5 O-GlcNAc促进β-catenin与EZH2的相互作用
β-catenin发生O-GlcNAc糖基化修饰后可招募EZH2并改变相关基因转录
DS aptamers可招募EZH2至启动子区域，并影响相关基因的转录水平（图5 A&B&C）.然而，其在-wnt和+wnt通路中对转录的影响不一样，这可能是由于O-GlcNAc修饰的β-catenin与ZEH2的相互作用被wnt通路本身掩盖了，但这种推测并没有得到进一步的解释。
图6 β-catenin发生O-GlcNAc糖基化修饰后可招募EZH2并改变相关基因转录
DS aptamers诱导的糖基化修饰可被核糖开关和Tet-on system调控
作者设计了与Mango结合的核糖开关，当体系中存在Mango配体OT1时，DS aptamers处于OFF状态，O-GlcNAc糖基化修饰活动停止（图7A&B&C）。另外，Tet-on system也被应用在了本体系中，当体系中存在Dox1时，atdT1转录产物增加，后者后影响DS aptamers的折叠，从而影响其糖基化修饰活动（图7F&G&H）。
图7 DS aptamers诱导的糖基化修饰可被riboswitches和Tet-on system调控
总结
本文实现了特定蛋白的O-GlcNAcylation，揭示了β-catenin的O-GlcNac位点，以及β-catenin下游作用蛋白和机制。DS aptamer linker在其发挥作用时发挥重用作用。局限性：O-GlcNAc或PEG与β-catenin结合后，影响其与现有已知的β-catenin抗体的结合，这意味着WB结果的可靠性受到影响。
Zhu, Yi, and Gerald W Hart. “Dual-specificity RNA aptamers enable manipulation of target-specific O-GlcNAcylation and unveil functions of O-GlcNAc on β-catenin.” Cell 2023, 186: 428-445.e27. doi:10.1016/j.cell.2022.12.016
