韩 达 课 题 组

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JACS丨桥接蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)能够降解不可成药的靶标

今天分享的是发表在J. Am. Chem. Soc.上的一篇文章,标题为“Bridged Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC) Enables Degradation of Undruggable Targets”本文的通讯作者是美国西奈山伊坎医学院的金坚教授,他的主要研究方向为靶向致癌蛋白的新型降解剂的发现。

研究背景

使用蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)靶向蛋白质降解是一种非常有前途的疾病治疗策略。由于PROTACs不需要高亲和结合靶点,也不需要与活性位点结合,因此它们有潜力靶向小分子抑制剂难以处理的疾病相关蛋白。然而,PROTAC也有一些自身的局限性,它只有通过直接与靶蛋白结合,才能达到相应的降解。目前为止, 700 多种确定的致癌蛋白中,大约只有40种蛋白有相应的小分子结合体,因此对于剩下的这些缺乏小分子结合体的不可成药靶点,亟需全新的策略予以靶向。

Cyclin D1(CCND1编码)是一种重要的细胞周期调节因子。cyclin D1在许多癌症类型中经常被扩增和过表达,包括食管癌、乳腺癌和肺癌等。Cyclin D1的消融可以保护小鼠免受癌基因诱导的乳腺癌,同时,以往的实验证实通过生物敲除cyclin D1的小鼠能够正常发育。综上所述,cyclin D1是一个很有希望的癌症治疗靶点。

然而目前为止,并没有能够靶向cyclin D1的小分子配体被报道。由于缺乏小分子结合物,传统的PROTAC策略无法靶向cyclin D1。在这个工作中,作者发展了基于桥接蛋白小分子结合体的异双功能小分子,通过拉近POIbridge protein形成的蛋白复合物与E3链接酶的距离,以达到对POI的泛素化及降解。由于与cyclin D1形成蛋白复合物的CDK4/6有高活性、高选择性的小分子抑制剂,因此,作者选择了cyclin D1作为研究靶标来验证bridged PROTAC 的想法 (图1A)

1. 首个cyclin D1降解剂MS28的发现

结果与讨论

首个Cyclin D1降解剂MS28的发现

首先基于FDA批准的CDK4/6抑制剂帕博西尼(PB)与E3连接酶配体VHL-1,作者设计了一系列的异双功能小分子,并评估了这些化合物在Calu-1细胞中降低cyclin D1蛋白水平的作用。其中,MS28(1B)可有效降解Calu-1细胞中的cyclin D1。同时,作者为MS28设计了两个对照化合物:MS28N1(可结合CDK4/6但不结合VHL)和MS28N2(可结合VHL但不结合CDK4/6) (图1C)

接下来,作者发现MS28在降解cyclin D1的同时,也可以一定程度上选择性地降解CDK6,同时在低浓度时对CDK4蛋白水平却没有影响。进一步的结果表明,MS28降解cyclin D1不是通过先降解CDK4/6来促进cyclin D1失稳降解的(图1D)。同时,作者在竞争性结合试验中评估了MS28MS28N1MS28N2PBCDK4/6的结合亲和力。与PB相比,MS28MS28N1CDK4/6保持了足够的结合亲和力。此外,MS28MS28N1CDK6的结合亲和力高于CDK4(1E),这可以解释MS28选择性降解CDK6而非CDK4

MS28优先降解Cyclin D1而不是CDK4/6

接下来,作者评估了MS28诱导的cyclin D1CDK4/6降解的时间过程。MS28早在1小时内就降解了大约50%cyclin D1,而CDK4/6的降解直到处理4小时才观察到(2A)。在几乎所有治疗时间点,MS28cyclin D1蛋白水平的降低程度均大于CDK4/6

Calu-1细胞中,MS28也以浓度依赖的方式降解cyclin D1,其DC50950±66 nM Dmax90±1%(2BC)。由于cyclin D1也是Rb-E2F通路下游的靶点,作者接下来通过RT-qPCR研究确定MS28CCND1CDK4/6 mRNA水平的影响。MS28PB均未改变CCND1CDK4CDK6mRNA水平(2D)。因此,cyclin D1的减少发生在蛋白质水平上,而不是由于转录的变化引起的。

2. Calu-1细胞系中,MS28选择性降解cyclin D1

MS28依赖于VHLCDK6UPS诱导了Cyclin D1降解

MS28要成为桥接PROTAC,它必须直接与CDK4/6结合,从而招募cyclin D1-CDK4/6复合物。作者已经证实MS28结合CDK4/6具有高亲和力(1E)。接下来,作者使用等温滴定量热法(ITC)评估了MS28cyclin D1的结合,并确认MS28不与cyclin D1结合,而阳性对照(基于CDK4/6cyclin D1结合序列的16 )cyclin D1结合。

S3. MS28不与cyclin D1结合。

因此,cyclin D1MS28降解不是由于cyclin D1MS28的直接相互作用,而是通过CDK4/6-cyclin D1复合物的结合发生的。

为了进一步证明由MS28介导的cyclin D1降解是通过招募VHLCDK6发生的,作者消融了VHLCDK6。具体来说,作者在Calu-1细胞中通过CRISPR-Cas9产生VHL敲除(KO)(3A)和通过siRNA产生CDK6敲除(KD)(3B)。当VHLCDK6耗尽时,MS28降解cyclin D1的能力显著减弱,这表明MS28通过将CDK6-cyclin D1复合物募集到VHL来降解cyclin D1

3. MS28依赖于VHLCDK6UPS途径降解cyclin D1

MS28的选择性研究

作者通过WB分析证实,除了cyclin D1CDK6CDK4(程度较小)外,MS28还降解了cyclin D3,并略微降低了cyclin A2的蛋白水平(4A)。作者还证实MS28没有降解cyclin D2或其他主要的cyclinCDKs,如cyclin B1CDK2。作者也评估了MS2858个激酶的选择性。MS281 μM时显著抑制CDK6,但对其他57种激酶无抑制作用(4B)。在一项基于无偏质谱(MS)的全球蛋白质组学分析研究中,作者发现在检测到的7500个蛋白质中,细胞周期蛋白D1CDK4/6是在用MS28处理的Calu-1细胞中显示蛋白质水平显著降低的一小部分蛋白质(S6)

S6. MS28选择性地降低了细胞周期蛋白D1和细胞周期相关靶点的蛋白水平。

此外,其他被MS28显著下调的蛋白大多具有细胞周期相关功能,因此,它们的下调可能是由于细胞周期进程的关键调控因子cyclin D1CDK4/6的降解。综上所述,这些结果支持MS28是一种选择性细胞周期蛋白D1/3CDK4/6降解剂。

 

4. MS28具有良好的靶点选择性。

MS28能有效抑制NSCLC细胞的生长

Cyclin D1以其对CDK4/6Rb-E2F通路的调控作用而闻名,作者接下来使用RT-qPCR评估MS28对下游E2F靶基因的影响。在Calu-1细胞中,MS28PB在处理8 h时显著降低E2F靶基因mRNA水平(5A)。重要的是,MS28 (GI50 = 1.0±0.32 μM)也比PBCDK4/6降解物BSJ更有效地抑制Calu-1细胞的增殖 (5B)。此外,作者在琼脂集落形成实验中评估了MS28MS28N1BSJPBCalu-1细胞克隆性的影响。在用每种0.3 μM的化合物处理20天后,MS28MS28N1BSJPB更能抑制Calu-1细胞的克隆性,在MS28处理条件下,所有的菌落直径都小于100 μM(5C)

接下来,我们研究了MS28在另一种NSCLC细胞系NCI-H2110中的降解作用。MS28优先降解cyclin D1,而BSJcyclin D1CDK4/6的降解没有影响(5D)。正如预期的那样,PBMS28N1MS28N2没有降解cyclin D1CDK4/6。有趣的是,在NCI-H2110细胞中,MS28cyclin D1的有效降解相反,在处理8 h时,略微降低了CDK4的水平,而对CDK6的水平没有影响,表明NCI-H2110细胞具有不同的降解动力学。此外,不同的细胞环境,如cyclin D1CDK4/6以及cyclin D1- CDK4cyclin D1- CDK6二元复合物的丰度,可能导致MS28的不同降解谱。

作者还在NCI-H2110细胞中测试了MS28PBBSJ对细胞活力的影响。与Calu-1细胞相似,MS28表现出优于PBBSJ的抗增殖作用(GI50 = 750±90 nM)(5E)。同时,作者在另一种癌症类型BT-549乳腺癌细胞系中评估了MS28。同样,MS28优先降解cyclin D1cyclin D3,而不是cyclin D2CDK2/4/6(S12)

S12. BT549细胞中,MS28优先降解细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白D3

接下来,作者评估了MS28对正常人PNT2细胞的细胞毒性。虽然MS28浓度依赖性地降低了cyclin D1CDK4/6蛋白水平,但在PNT2细胞中并没有表现出明显的抗增殖作用(S13)

S13.MS28可降解PNT2正常人细胞系中的cyclin D1CDK4/6,并对其无毒。

这说明cyclin D1CDK4/6的降解对正常细胞无毒。最后,作者评估了MS28的小鼠PK特性。单次腹腔注射30mg /kg剂量的MS28后,血浆中化合物浓度维持在1 μM以上长达12小时(S14)

S14。小鼠单次腹腔注射30mg/kg后,血浆MS28浓度超过12小时。

 

5. 在肿瘤细胞中MS28有效抑制Rb-E2F信号通路,以及相应肿瘤增殖。

总结

目前基于小分子的PROTAC方法需要POI的小分子结合剂,这意味着缺乏小分子结合剂的不可成药蛋白质不能被这些传统的PROTAC方法靶向。在这项研究中,作者提出了一种新的桥接PROTAC策略,并证明了这种桥接PROTAC策略在降解cyclin D1(一种不可药蛋白)方面的适用性。总的来说,桥接PROTAC策略有潜力靶向目前不可成药的蛋白质,如TFs(缺乏小分子结合剂,但与其他具有良好特征的小分子配体的蛋白质相互作用)。这个潜在的可推广平台可以扩展可靶向的人类蛋白质组。

 

2023年1月18日 17:35
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