JACS丨桥接蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）能够降解不可成药的靶标

今天分享的是发表在J. Am. Chem. Soc.上的一篇文章，标题为“Bridged Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC) Enables Degradation of Undruggable Targets”本文的通讯作者是美国西奈山伊坎医学院的金坚教授，他的主要研究方向为靶向致癌蛋白的新型降解剂的发现。

研究背景

使用蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)靶向蛋白质降解是一种非常有前途的疾病治疗策略。由于PROTACs不需要高亲和结合靶点，也不需要与活性位点结合，因此它们有潜力靶向小分子抑制剂难以处理的疾病相关蛋白。然而，PROTAC也有一些自身的局限性，它只有通过直接与靶蛋白结合，才能达到相应的降解。目前为止， 在700 多种确定的致癌蛋白中，大约只有40种蛋白有相应的小分子结合体，因此对于剩下的这些缺乏小分子结合体的“不可成药”靶点，亟需全新的策略予以靶向。

Cyclin D1(由CCND1编码)是一种重要的细胞周期调节因子。cyclin D1在许多癌症类型中经常被扩增和过表达，包括食管癌、乳腺癌和肺癌等。Cyclin D1的消融可以保护小鼠免受癌基因诱导的乳腺癌，同时，以往的实验证实通过生物敲除cyclin D1的小鼠能够正常发育。综上所述，cyclin D1是一个很有希望的癌症治疗靶点。

然而目前为止，并没有能够靶向cyclin D1的小分子配体被报道。由于缺乏小分子结合物，传统的PROTAC策略无法靶向cyclin D1。在这个工作中，作者发展了基于桥接蛋白小分子结合体的异双功能小分子，通过拉近POI和bridge protein形成的蛋白复合物与E3链接酶的距离，以达到对POI的泛素化及降解。由于与cyclin D1形成蛋白复合物的CDK4/6有高活性、高选择性的小分子抑制剂，因此，作者选择了cyclin D1作为研究靶标来验证bridged PROTAC 的想法 (图1A)。

图1. 首个cyclin D1降解剂MS28的发现

结果与讨论

首个Cyclin D1降解剂MS28的发现

首先基于FDA批准的CDK4/6抑制剂帕博西尼（PB）与E3连接酶配体VHL-1，作者设计了一系列的异双功能小分子，并评估了这些化合物在Calu-1细胞中降低cyclin D1蛋白水平的作用。其中，MS28(图1B)可有效降解Calu-1细胞中的cyclin D1。同时，作者为MS28设计了两个对照化合物：MS28N1（可结合CDK4/6但不结合VHL）和MS28N2（可结合VHL但不结合CDK4/6） (图1C)。

接下来，作者发现MS28在降解cyclin D1的同时，也可以一定程度上选择性地降解CDK6，同时在低浓度时对CDK4蛋白水平却没有影响。进一步的结果表明，MS28降解cyclin D1不是通过先降解CDK4/6来促进cyclin D1失稳降解的（图1D）。同时，作者在竞争性结合试验中评估了MS28、MS28N1、MS28N2和PB与CDK4/6的结合亲和力。与PB相比，MS28和MS28N1与CDK4/6保持了足够的结合亲和力。此外，MS28和MS28N1与CDK6的结合亲和力高于CDK4(图1E)，这可以解释MS28选择性降解CDK6而非CDK4。

MS28优先降解Cyclin D1而不是CDK4/6

接下来，作者评估了MS28诱导的cyclin D1和CDK4/6降解的时间过程。MS28早在1小时内就降解了大约50%的cyclin D1，而CDK4/6的降解直到处理4小时才观察到(图2A)。在几乎所有治疗时间点，MS28对cyclin D1蛋白水平的降低程度均大于CDK4/6。

在Calu-1细胞中，MS28也以浓度依赖的方式降解cyclin D1，其DC50为950±66 nM， Dmax为90±1%(图2B，C)。由于cyclin D1也是Rb-E2F通路下游的靶点，作者接下来通过RT-qPCR研究确定MS28对CCND1和CDK4/6 mRNA水平的影响。MS28和PB均未改变CCND1、CDK4和CDK6的mRNA水平(图2D)。因此，cyclin D1的减少发生在蛋白质水平上，而不是由于转录的变化引起的。

图2. 在Calu-1细胞系中，MS28选择性降解cyclin D1。

MS28依赖于VHL、CDK6和UPS诱导了Cyclin D1降解

MS28要成为桥接PROTAC，它必须直接与CDK4/6结合，从而招募cyclin D1-CDK4/6复合物。作者已经证实MS28结合CDK4/6具有高亲和力(图1E)。接下来，作者使用等温滴定量热法(ITC)评估了MS28与cyclin D1的结合，并确认MS28不与cyclin D1结合，而阳性对照(基于CDK4/6与cyclin D1结合序列的16 肽)与cyclin D1结合。

图S3. MS28不与cyclin D1结合。

因此，cyclin D1被MS28降解不是由于cyclin D1与MS28的直接相互作用，而是通过CDK4/6-cyclin D1复合物的结合发生的。

为了进一步证明由MS28介导的cyclin D1降解是通过招募VHL和CDK6发生的，作者消融了VHL和CDK6。具体来说，作者在Calu-1细胞中通过CRISPR-Cas9产生VHL敲除(KO)(图3A)和通过siRNA产生CDK6敲除(KD)(图3B)。当VHL或CDK6耗尽时，MS28降解cyclin D1的能力显著减弱，这表明MS28通过将CDK6-cyclin D1复合物募集到VHL来降解cyclin D1。

图3. MS28依赖于VHL、CDK6和UPS途径降解cyclin D1。

MS28的选择性研究

作者通过WB分析证实，除了cyclin D1、CDK6和CDK4(程度较小)外，MS28还降解了cyclin D3，并略微降低了cyclin A2的蛋白水平(图4A)。作者还证实MS28没有降解cyclin D2或其他主要的cyclin和CDKs，如cyclin B1和CDK2。作者也评估了MS28对58个激酶的选择性。MS28在1 μM时显著抑制CDK6，但对其他57种激酶无抑制作用(图4B)。在一项基于无偏质谱(MS)的全球蛋白质组学分析研究中，作者发现在检测到的7500个蛋白质中，细胞周期蛋白D1和CDK4/6是在用MS28处理的Calu-1细胞中显示蛋白质水平显著降低的一小部分蛋白质(图S6)。

图S6. MS28选择性地降低了细胞周期蛋白D1和细胞周期相关靶点的蛋白水平。

此外，其他被MS28显著下调的蛋白大多具有细胞周期相关功能，因此，它们的下调可能是由于细胞周期进程的关键调控因子cyclin D1和CDK4/6的降解。综上所述，这些结果支持MS28是一种选择性细胞周期蛋白D1/3和CDK4/6降解剂。

图4. MS28具有良好的靶点选择性。

MS28能有效抑制NSCLC细胞的生长

Cyclin D1以其对CDK4/6和Rb-E2F通路的调控作用而闻名，作者接下来使用RT-qPCR评估MS28对下游E2F靶基因的影响。在Calu-1细胞中，MS28和PB在处理8 h时显著降低E2F靶基因mRNA水平(图5A)。重要的是，MS28 (GI50 = 1.0±0.32 μM)也比PB和CDK4/6降解物BSJ更有效地抑制Calu-1细胞的增殖 (图5B)。此外，作者在琼脂集落形成实验中评估了MS28、MS28N1、BSJ和PB对Calu-1细胞克隆性的影响。在用每种0.3 μM的化合物处理20天后，MS28比MS28N1、BSJ或PB更能抑制Calu-1细胞的克隆性，在MS28处理条件下，所有的菌落直径都小于100 μM(图5C)。

接下来，我们研究了MS28在另一种NSCLC细胞系NCI-H2110中的降解作用。MS28优先降解cyclin D1，而BSJ对cyclin D1和CDK4/6的降解没有影响(图5D)。正如预期的那样，PB、MS28N1和MS28N2没有降解cyclin D1和CDK4/6。有趣的是，在NCI-H2110细胞中，MS28与cyclin D1的有效降解相反，在处理8 h时，略微降低了CDK4的水平，而对CDK6的水平没有影响，表明NCI-H2110细胞具有不同的降解动力学。此外，不同的细胞环境，如cyclin D1、CDK4/6以及cyclin D1- CDK4或cyclin D1- CDK6二元复合物的丰度，可能导致MS28的不同降解谱。

作者还在NCI-H2110细胞中测试了MS28、PB和BSJ对细胞活力的影响。与Calu-1细胞相似，MS28表现出优于PB和BSJ的抗增殖作用(GI50 = 750±90 nM)(图5E)。同时，作者在另一种癌症类型BT-549乳腺癌细胞系中评估了MS28。同样，MS28优先降解cyclin D1和cyclin D3，而不是cyclin D2和CDK2/4/6(图S12)。

图S12. 在BT549细胞中，MS28优先降解细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白D3。

接下来，作者评估了MS28对正常人PNT2细胞的细胞毒性。虽然MS28浓度依赖性地降低了cyclin D1和CDK4/6蛋白水平，但在PNT2细胞中并没有表现出明显的抗增殖作用(图S13)

图S13.MS28可降解PNT2正常人细胞系中的cyclin D1和CDK4/6，并对其无毒。

这说明cyclin D1和CDK4/6的降解对正常细胞无毒。最后，作者评估了MS28的小鼠PK特性。单次腹腔注射30mg /kg剂量的MS28后，血浆中化合物浓度维持在1 μM以上长达12小时(图S14)。

图S14。小鼠单次腹腔注射30mg/kg后，血浆MS28浓度超过12小时。

图5. 在肿瘤细胞中MS28有效抑制Rb-E2F信号通路，以及相应肿瘤增殖。

总结

目前基于小分子的PROTAC方法需要POI的小分子结合剂，这意味着缺乏小分子结合剂的不可成药蛋白质不能被这些传统的PROTAC方法靶向。在这项研究中，作者提出了一种新的桥接PROTAC策略，并证明了这种桥接PROTAC策略在降解cyclin D1(一种不可药蛋白)方面的适用性。总的来说，桥接PROTAC策略有潜力靶向目前不可成药的蛋白质，如TFs(缺乏小分子结合剂，但与其他具有良好特征的小分子配体的蛋白质相互作用)。这个潜在的可推广平台可以扩展可靶向的人类蛋白质组。