Nat Commun丨基于DNA的生物体内高效和精准靶向的生物正交催化平台

大家好，本次分享的文献是2022年3月发表在Nature Communications上的“DNA-based platform for efficient and precisely targeted bioorthogonal catalysis in living systems”。通讯作者是中国科学院长春应化所曲晓刚、任劲松、蒲芳和李光明研究员。他们构建了基于单链DNA的铜纳米颗粒，能够靶向肿瘤细胞催化点击反应激活前药，具有生物相容性、靶向性和催化活性高的优点。

背景

作为常见的点击反应之一，Cu(Ⅰ)催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）在药物发现、生物偶联和材料科学等领域有广泛的应用，但Cu(I)会损害正常细胞，阻碍了其在生命体系中的应用。为了消除Cu(I)的毒性作用，前人进行了生物相容性的改造，包括载体稳定Cu(I)、抗坏血酸钠原位还原Cu(II)或采用金属铜纳米颗粒和纳米氧化铜。然而，这些方法仍然存在收率低、活细胞内难以满足反应条件、催化剂的非特异性分布引起副作用等问题。

基于DNA的以下特性：1）DNA可以作为模板合成金属纳米颗粒，且纳米颗粒的大小可以通过DNA的长度和序列精确控制。2）单链DNA的核酸适配体可特异性结合癌细胞上过表达的受体。3）DNA链可用于调节纳米催化剂的催化活性。可利用DNA设计生物相容性好、催化活性和靶向性高的CuAAC催化剂。

研究内容

1.基于DNA的铜纳米颗粒的设计与表征

作者首先设计了基于单链DNA的铜纳米颗粒，其中单链DNA由三个结构域组成：5’端为富含胸腺嘧啶(T)的序列，可作为铜纳米颗粒CuNPs的合成模板；3’端为核酸适配体，可识别不同的靶标；中间的15个核苷酸的Linker，用于连接富T区域和核酸适配体。随后，他们分别设计了含有20、30和40个T的单链DNA，并以三者为模板合成了铜纳米颗粒，分别简写为Apt-Cu²⁰、 Apt-Cu³⁰和 Apt-Cu⁴⁰(图1a)。对三种纳米复合物进行表征：原子力显微镜(AFM)表明一条单链DNA合成一个CuNP；X射线光电子能谱(XPS)证实了0价铜的产生(图1d)；透射电子显微镜（TEM）发现CuNPs尺寸随T数目的增加而增大(图1b)。荧光光谱结果显示在紫外灯的照射下，三者均发出红色荧光，且荧光强度随T数量的增加而显著增强(图1c)。以上实验表明成功合成了基于DNA的铜纳米颗粒。

2. 基于DNA的铜纳米颗粒的体外催化性能

选择非荧光的前体1（3-叠氮-7-羟基香豆素）和2（苯乙炔）在催化剂的催化下转化为具有荧光的产物3（苯三唑），作为模型反应进行催化剂体外催化性能测定(图2a)。通过荧光光谱法，测得反应速率大小依次为：Apt-Cu³⁰ > Apt-Cu⁴⁰ > Apt-Cu²⁰(图2b)。利用高效液相色谱(HPLC)分析转化率随时间的变化，发现Apt-Cu³⁰的催化下，90%的底物在60分钟内转化为产物，催化能力比CuSO₄/抗坏血酸高一个数量级。随后的一系列对照实验证明核酸适体区域不影响纳米复合物Apt-Cu³⁰的催化活性，而缺少聚T区域导致催化能力很低，更重要的是Apt-Cu³⁰在生理条件下催化能力依旧较高。

一般来说，催化剂粒径越小，催化能力越强。前面已发现Apt-Cu²⁰粒径最小，但是催化性能却最差。研究人员给出两点解释：一是T数目越少，合成的铜纳米颗粒稳定性越差，Apt-Cu²⁰具有最差的稳定性；二是XPS显示Apt-Cu²⁰存在Cu（Ⅱ），Cu（0）含量仅为38.8%（图2c）。最后作者考察了DNA单链对纳米复合物催化活性的影响，分子动力学模拟发现底物1与2通过氢键和疏水力与DNA不同位点相互作用，导致反应组分在DNA附近浓度较高且接近催化位点，从而催化能力增强(图2d)。

3.生物相容性分析

鉴于含有30个T的单链DNA合成的铜纳米颗粒催化性能最好，作者构建了基于T30-Linker-MUC1适体的铜纳米颗粒（其中MUC1适体能够靶向MUC1粘蛋白），简称MApt-Cu³⁰，作为后续细胞和动物实验的研究对象，并以不含核酸适体DNA合成的铜纳米颗粒(简称WA-Cu³⁰)作为对照。

首先利用MTT比色法进行了细胞毒性研究：分析不同浓度MApt-Cu³⁰处理多种细胞后的细胞活力变化，发现即使在50μM浓度下，细胞活力依然很高，表明MApt-Cu³⁰无细胞毒性(图3a)。随后利用无胸腺裸鼠模型进行了系统的毒理学研究，阐明MApt-Cu³⁰在体内的安全性：1）溶血实验证明在3.125-50μM浓度的MApt-Cu³⁰处理下红细胞未发生溶血(图3b)；2）血液学分析与血液生化检测表明MApt-Cu³⁰的长期毒性较小；3）小鼠体重变化表明MApt-Cu³⁰对小鼠生长影响可以忽略(图3c)；4）苏木精、伊红（HE）染色发现MApt-Cu³⁰没有引起器官损伤或不良反应(图3d)。以上实验表明，MApt-Cu³⁰具有生物相容性。

4.细胞靶向能力测试

使用MUC1阳性(MUC1+)癌细胞系(A549和MCF-7)、MUC1阴性(MUC1-)癌细胞系(HepG2和MDA-MB-231)、正常细胞(NIH-3T3和RAW)探索MApt-Cu³⁰识别不同细胞的能力。共聚焦显微镜结果显示，对于MApt-Cu³⁰孵育的MUC1+细胞，绿色细胞膜内表现出强烈红光，而MUC1-细胞和正常细胞仅有微弱红光(图4a)。此外，流式细胞术结果表明对于MUC1+细胞，与WA-Cu³⁰处理相比，采用MApt-Cu³⁰处理具有可见的右移和高荧光强度比，而在相同的条件下观察到正常细胞或MUC1-胞两者差别不大(图4b)。以上实验表明，MApt-Cu³⁰可以区分特定类型的癌细胞，并实现靶向癌细胞积累。

5.活细胞内靶向前药激活

在证明了MApt-Cu³⁰对MUC1+细胞的优越靶向性能后，作者进一步研究了MApt-Cu³⁰应用于细胞内靶向催化CuAAC反应以实现前药活化的表现。选择前药4、5发生CuAAC反应生成白藜芦醇（Rsv）类似物6作为模型反应进行后续研究(图5a)。首先通过MTT法发现只有前体药物的情况下，所有细胞活性均较高(图5b)，但在添加MApt-Cu³⁰后，MUC1+细胞活力显著下降，而MUC1-和正常细胞活力轻微下降(图5c)，表明前体药物在MApt-Cu³⁰催化下产生了细胞毒性。结合HPLC和 LC-MS结果证明CuAAC反应在活细胞内顺利进行，成功合成了Rsv类似物6。最后，流式细胞术双重染色分析结果表明MUC1+细胞死亡主要与细胞凋亡有关(图5d)。以上实验表明，MApt-Cu³⁰可以在特定类型癌细胞中催化CuAAC反应使前药活化，引起肿瘤细胞的凋亡。

6.生物体内靶向前药激活

接下来，作者探索了MApt-Cu³⁰在体内催化CuAAC反应中用于癌症靶向治疗的效果。首先通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)研究MApt-Cu³⁰的生物分布：在携带MUC1+肿瘤的裸鼠中，MApt-Cu³⁰4小时内基本完成在肿瘤的积累，24小时积累量仅下降16%，表明MApt-Cu³⁰在MUC1+肿瘤中具有良好的聚集性和保留性(图6a)。接下来通过与对照组比较切除肿瘤的大小，发现前药+ MApt-Cu³⁰显著降低MUC1+裸鼠的肿瘤生长率(图6c)。同时HE染色分析表明肿瘤细胞凋亡数目显著增加(图6d)。最后采用HPLC对产物6进行了药代动力学分析:两种前体药物和产物6均在30分钟内达到血液中的峰值浓度，而产物6的浓度相比前药较低(图6b)。以上实验表明MApt-Cu³⁰能够在MUC1+肿瘤中积累，催化CuAAC反应激活前药，实现对肿瘤细胞的靶向杀伤。

7．验证平台的通用性

最后以特异性结合核仁素的AS1411适体构建的单链DNA合成了铜纳米颗粒(简称AApt-Cu³⁰),并利用相似的策略进行研究，同样证实了AApt-Cu³⁰具有生物相容性以及可被目标细胞特异性内化并表现出优异的细胞内催化性能。这说明基于DNA的铜纳米颗粒是一个通用的平台，可以通过更改适体的类型实现个性化治疗。

结论

该研究工作成功设计并构建了基于DNA的铜纳米颗粒用于催化点击反应，表现出优良的生物相容性、催化性能以及靶向能力。其中单链DNA的序列和结构起到关键作用：聚T区域充当铜纳米颗粒的合成模板与载体；适体区域可以识别目标细胞，且可以通过更改适体类型实现癌症个性化治疗；中间的寡核苷酸连接区域还可通过与底物的相互作用促进催化性能。该纳米催化剂在体内前药激活中具有广阔的应用前景。

原文链接： https://doi.org/10.1038/s41467-022-29167-x