ANGEW丨工程化层级识别介导的抗衰老药物用于调节细胞衰老和抗动脉粥样硬化治疗

大家好，今天给大家分享一篇来自湖南大学化学化工学院刘艳岚课题组发表在Angew Chem Int Ed上的Engineering Hierarchical Recognition-Mediated Senolytics for Reliable Regulation of Cellular Senescence and Anti-Atherosclerosis Therapy。

背景介绍：

       当细胞长期遭受各种内在和外界压力时，细胞自身的修复机制会出现失代偿，并逐渐积累大量有害物质，最终导致不可逆的细胞周期停滞，这个过程称为细胞衰老。这种累积性的细胞衰老不但会加速周围组织的衰老，还会破坏周围组织的稳态，并通过衰老相关的分泌表型（SASP）引发慢性炎症，导致组织重塑。当细胞衰老发生在脉管系统时，又称为“血管”衰老，其与各种血管和代谢疾病密切相关，如心衰、心肌梗塞和动脉粥样硬化等。因此改善血管衰老的策略在各种疾病的治疗和健康长寿方面有巨大的潜能。

       目前的各种抗衰老药物虽然能够通过干扰衰老细胞的凋亡抵抗，有效地清除衰老细胞，但此类药物在临床上常引起严重的副作用。为减少不良反应，目前常采用前药的策略是把抗衰老药物设计成可激活的形式，使其能够在细胞衰老的各种特征下发生响应并原位释放药物，其中最常见的响应条件是衰老细胞中与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β- gal）。但由于SA-β- gal是衰老细胞的一个普遍特征，其特异性较低，因而“脱靶”毒性仍难以避免。因此，增强各种前药的主动细胞靶向是目前迫切需要解决的问题。基于此，作者巧妙地提出了核酸适体-前药的概念，它能够实现层次识别，从而精确地抗衰老治疗，并在调节血管衰老方面具有良好效果。

结果与讨论：

            图1. ApMSPdβ-gal的分子结构和激活机制

       如图1所示，ApMSPdβ-gal包含3个部分，分别为（1）能够主动识别衰老内皮细胞的靶向细胞黏附分子（L1CAM）的核酸适体，该适体能够识别不同刺激引起的衰老内皮细胞，并能很好地区别衰老和静止细胞；（2）能够与衰老细胞中溶酶体SA-β- gal发生响应并“开启”药物活性的连接子，用于实现药物的原位释放；（3）EF24，一种抗凋亡抑制剂，能够触发caspase 3/7介导的衰老细胞凋亡，抑制衰老诱导的动脉粥样硬化进展。

图2. 衰老内皮细胞的构建和抗L1CAM核酸适体结合的验证

       作者首先选取了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为血管内皮细胞的模型，并采用阿霉素（DOX）、X射线、基因毒性应激（BrdU）、D-半乳糖和H2O2刺激分别成功构建了衰老内皮细胞的模型，表现为SA-β-gal含量升高（图2 A）、细胞分化停滞（图2 B）。随后通过蛋白印记验证了衰老细胞中L1CAMb蛋白表达上调（图2 C）。作者还通过细胞流式验证了抗L1CAM的核酸适体能够有效区分衰老和非衰老细胞（图2 D）。

图 3. ApMSPdβ-gal的合成与表征

       确定了适体能够特异性识别衰老内皮细胞后，作者巧妙地设计了具有活细胞靶向功能的抗衰老药物ApMSPdβ-gal，其合成路线如图3A所示，其设计思路为首先利用适体主动识别衰老细胞，随后在衰老细胞内被SA-β-gal酶激活切割，实现原位释放药物分子EF24。为了验证β-gal的选择性激活机制，作者将ApMSPdβ-gal分别与β-gal及其它常用酶（GSH、Lysozyme、Cys等）共孵育，并通过反相高效液相色谱（HPLC）监测EF24的释放，结果表明只有在β-gal存在的情况下EF24才能被释放，证明ApMSPdβ-gal能被SA-β-gal特异性响应（图3B-C）。

图4. ApMSPdβ-gal对不同衰老细胞内皮细胞中的识别及在溶酶体富集

       验证了ApMSPdβ-gal能与SA-β-gal特异性响应后，作者继续探索了其对各种衰老内皮细胞的细胞靶向能力。通过细胞流式（图4 B）及共聚焦（图4 C）实验表明ApMSPdβ-gal能够精确地识别衰老细胞，并有效地区分出非衰老细胞。随后进一步考察了ApMSPdβ-gal与衰老细胞溶酶体之间的关系，作者选取了在溶酶体内无响应的ApMSPdglucose与溶酶体进行共定位分析，结果表明ApMSPdglucose能够在溶酶体内大量积累（图4 D），验证了ApMSPdβ-gal在识别衰老细胞后能够在溶酶体内富集并释放药物。

图5. ApMSPdβ-gal特异性清除衰老细胞

       证实了ApMSPdβ-gal具有良好的细胞靶向能力后，作者评估了其在各种衰老内皮细胞中的抗衰老效应。由于缺乏靶向性，游离的EF24药物对衰老细胞和非衰老细胞均表现出浓度依赖的细胞毒性（图5 A），尽管衰老内皮细胞的IC50略高于非衰老细胞，但其衰老指数（SI = IC50non-senescence/IC50senescence）均小于2（图5 B），表明EF24的治疗窗口非常小，这也是EF24在临床研究中面临的问题。而用ApMSPdβ-gal处理细胞后，衰老细胞的细胞毒性显著高于非衰老细胞（图5 C），且SI值相对于游离EF24增加了10倍（图5 D），表明ApMSPdβ-gal显著提高了EF24的抗衰老效应。值得注意的是，ApMSPdglucose治疗仅能诱导40%的衰老细胞死亡，而ApMSPdβ-gal处理后，超过90%的衰老细胞被杀死。因此可以推测ApMSPdβ-gal显著的抗衰老效果是得益于核酸适体介导的识别和SA-β-gal特异性响应两者共同作用的结果（图5 E）。为了证明该猜想，作者选取了H2O2诱导的衰老内皮细胞进行流式验证（图5 F）。结果表明，游离的EF24在衰老细胞及非衰老细胞中均引起明显的细胞凋亡。ApMSPdβ-gal处理后则仅在衰老细胞观察到显著凋亡，且对照组 ConMSPdβ-gal处理后的两种细胞则无明显凋亡现象，表明适体介导的靶向识别对发挥药效有关键作用。随后的caspase-3/7染色结果表明相对于ConMSPdβ-gal，ApMSPdβ-gal能够更显著地触发caspase-3/7介导的细胞凋亡(图5 G)。因此，以上结果表明ApMSPdβ-gal能够扩大药物的治疗窗口并提高生物安全性。

图6. 抗L1CAM适体对动脉粥样硬化斑块中衰老内皮细胞的靶向能力

       接下来作者用动脉粥样硬化小鼠模型探索了ApMSPdβ-gal调节血管衰老的潜力。作者首先用Oil Red 染色验证了高脂小鼠主动脉中存在脂质沉积（图6 A），且SA-β-gal染色表明脂质沉积中有大量SA-β-gal表达（图6 B），表明在斑块的内膜及内部存在大量衰老细胞。L1CAM抗体免疫荧光实验显示脂质斑块中L1CAM的表达明显增多。这些结果表明，动脉粥样斑块中富含衰老细胞，且具有L1CAM表达上调的特征。随后作者用荧光成像考察了适体对动脉粥样斑块的靶向性，结果与L1CAM抗体免疫荧光一致，表明适体主要靶向斑块中的衰老内皮细胞（图6 D）。为了进一步阐明适体与衰老内皮细胞的关系，作者分别对斑块切片进行了L1CAM和CD31（内皮细胞标记物）的免疫荧光染色、SA-β-gal染色以及适体孵育，并进行了荧光共定位分析。如图6 E-G所示，CD31/Aptamer/SA-β-gal与L1CAM抗体存在大量的共定位现象，进一步证实了图的靶标是斑块中的衰老内皮细胞。

 图7. ApMSPdβ-gal体内抗动脉粥样硬化作用

       最后，作者评估了ApMSPdβ-gal抗动脉粥样硬化作用。小鼠分为5组，通过尾静脉注射分别给予PBS、游离EF24、ConMSPdβ-gal、 ApMSPdglucose和ApMSPdβ-gal处理，最后收集主动脉进行Oil Red 和SA-β-gal染色分析（图7 A）。结果表明，与PBS组相比，游离EF24-、ConMSPdβ-gal和ApMSPdglucose处理组的斑块大小未见明显差异，而ApMSPdβ-gal组的斑块最少，表明斑块的形成被明显抑制（图7 B和D）。EF24处理组的SA-β-gal阳性区仅略有减少，提示游离EF24在体内具有较弱的抗衰老活性。相反，ApMSPdβ-gal组的SA-β-gal阳性区显著减少，表明具有较强的抗衰老作用（图7 E和G）。 为了更准确地评估抗衰老效应，作者用SA-β-gal的荧光探针SPiDER-βGal分析了主动脉根切片中SA-β-gal的水平。同时用CD31和F4/80抗体标记了ECs和巨噬细胞，用荧光共定位和细胞计数来评估了衰老细胞的百分比。与PBS组相比，ApMSPdβ-gal处理后衰老的内皮细胞和巨噬细胞明显减少（7 H）。考虑到衰老细胞可通过SASP破坏斑块的稳定，增加斑块破裂的风险，作者进一步比较了PBS和ApMSPdβ-gal两组的纤维帽厚度。结果表明，ApMSPdβ-gal组消除衰老细胞的同时，也增加了斑块的纤维帽厚度，降低了斑块破裂的风险。

总结

综上所述，本文提出了一种新的采用核酸适体介导的活性细胞识别与多重靶标共同激活的前药用于抗衰老治疗。具有靶向能力的ApMSPdβ-gal能够主动靶向衰老的内皮细胞和泡沫巨噬细胞，引发细胞凋亡，有助于减少动脉粥样硬化模型的斑块面积。该策略有望成为一种通用工具，在实现老年相关疾病的预防和治疗方面有较大的应用潜力。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202214169