Nat Protoc丨通过球形核酸转染蛋白质
本次给大家分享的是2022年1月发表在Nature Protocols上的一篇文章，题目是Protein transfection via spherical nucleic acids.
作者介绍
本文的通讯作者是美国西北大学的查德·米尔金教授（Chad A. Mirkin），主要从事纳米技术及生物医学工程等领域的研究。
Chad A. Mirkin教授
背景介绍
蛋白质分子功能广泛，已广泛用于生物传感器及治疗药物等的开发研究。例如，输送正常活性蛋白至细胞中以取代失调蛋白质发挥功能；特异性检测细胞内小分子及酶活性等。然而，大多数蛋白质的细胞不渗透性及复杂生物环境中的降解倾向，使其在疾病治疗和生物传感等领域中的应用存在着一定的局限性，因此，开发一种通用的、高效的、特异性的输送方法，将极大提高蛋白质的应用前景。本篇文章中，作者团队介绍了一种以蛋白质为核心、径向排列的DNA为外壳的球形纳米粒子，称为蛋白质球形核酸（ProSNAs）（图 1）。DNA外壳极大的提高了蛋白质的抗酶解能力；此外，还可对核酸序列的长度，碱基及修饰密度等进行调整以满足不同的功能需求。
图1. 蛋白质球形核酸
ProSNAs的合成、纯化与表征
ProSNAs的合成是以NHS-PEG4-Azide分子为Linker，将DBCO修饰的核酸分子共价偶联至蛋白表面的氨基上，此外还可通过马来酰亚胺与巯基之间的反应在蛋白上引入荧光基团；合成中间体及产物可通过超滤、脱盐及FPLC进行纯化，通过紫外、凝胶电泳、CD光谱及蛋白活性测试等方法进行表征（图2）。
图2. ProSNAs的合成、纯化与表征的实验流程图
本文中，作者以β-Gal为模型蛋白合成了ProSNAs，并通过一系列的体外表征实验证明，在DNA功能化后，蛋白质的结构与活性均得到了很好的保留（图3）。
图3. ProSNAs的表征
ProSNAs的细胞内化及细胞内活性研究
作者使用流式细胞术研究了β-Gal SNAs进入细胞的能力，结果表明，与天然蛋白质不同，即使低至0.1 nM的β-Gal SNAs也能够大量进入不同种类的细胞(图4a、b)；此外，使用细胞通透性的比色和荧光底物，均表明β-Gal SNAs在细胞内保持了较高的酶活性(图4c、d)。
图4. ProSNAs进入体外培养细胞的能力及胞内活性
基于ProSNAs的细胞内传感器研究
ProSNAs可作为活细胞探针用于细胞内小分子或酶活性的特异性检测，本文中，作者使用Gox SNAs监测细胞内葡萄糖浓度的变化。GOx SNAs能够催化β-D-glucose生成D-glucono-1,5-lactone和H2O2，加入H2O2敏感染料如FBBBE后，即可发出荧光。通过体外荧光实验证明Gox SNAs维持了天然Gox的高催化活性和特异性（图 5a、b）；流式细胞术分析结果表明GOx SNAs可以用于动态检测细胞内葡萄糖水平的变化（图 5c、d）。
图 5. Gox SNAs用于缓冲液中及细胞内葡萄糖的检测
ProSNAs可用于功能性蛋白的活体递送
在活体，与天然蛋白相比，ProSNAs表现出不同的药代动力学和组织器官分布。例如，β-Gal SNA能够在小鼠血清和器官中保留更长的时间，并且维持了较高的生物学活性（图7）。
图6. 活体中ProSANs的分布与活性。
总结
作者团队开发了一种以蛋白质为核、核酸为壳的蛋白质球形核酸纳米粒子。在保持蛋白质活性的前提下，提高了其抗酶解和进细胞的能力，于生物传感、疾病诊断和治疗等领域具有一定的应用前景。
