韩 达 课 题 组

韩 达 课 题 组

Nat Commun丨通过碱基切除捕获进行高效的DNA荧光标记

今天介绍的文献是今年8月份发表在Nature Communication上的Efficient DNA fluorescence labeling via base excision trapping

作者介绍:

通讯作者Eric T. Kool教授是斯坦福大学化学系教授。他的研究方向包括发展化学工具研究RNA结构及其相互作用,研究DNA修复途径及其与疾病间的联系。

背景介绍:

荧光标记的DNA是基础和应用生物科学分析的基本工具。DNA非共价染料已被用于PCR等实验,但共价标记的DNA具有更高的特异性。由于用途广泛,许多DNA共价标记方法已经被开发出来,主要包括在化学合成或酶合成DNA期间直接进行DNA的荧光共价标记。在化学合成过程中,直接使用与荧光团偶联的亚磷酰胺试剂合成寡核苷酸(ODNs)可提高产率并精确定位,但这些化合物不稳定且成本高昂,其使用仅限于短于~ 200 ntDNA和具有寡核苷酸合成能力的实验室。此外,酶合成法则限制了酶活性位点所能接受的化合物结构,也限制了染料掺入的位置。

合成后标记可以绕过酶-底物耐受性的限制,允许使用含有较小反应基团的修饰核苷酸(如叠氮化物和炔)作为聚合酶的底物。本文中,作者报道了一种用于寡核苷酸和dsDNA的原位DNA标记策略。这一策略是基于他们的前期工作,酶将错配碱基切除后裸露出碱基切除位点,随后利用universal base excision reporters (UBER)将碱基切除位点进行标记。

本文中,该方法包括(i)化学或酶合成含有一个或多个脱碱基位点的DNA链,(ii)进行碱基切除修复(BER),即细菌糖基化酶切除碱基,生成反应性AP(缺碱基)位点,(iii) AP位点和UBER染料发生化学反应,形成肟键。本文中使用的脱碱基前体如dUTPdITP(脱氧肌酐)在插入DNA之前不是糖基酶的底物,这避免了分离步骤;UBERsAP位点的快速化学反应,生成增强的荧光信号(高达500),这可以避免清洗步骤。并且这些反应是相互正交的,使用商品化的试剂,即可在一个反应管中实现DNA的原位合成、修复和标记过程,程序简单,操作方便。

 

结果介绍:

含尿嘧啶DNA的原位共价标记

研究人员测试了共价标记所需的时间。他们用细菌尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)切除DNA中的脱氧尿苷(dU)后,使用CCVJ-1共价标记含有一个dUdsDNA,这一碱基切除-标记过程大约在30min内完成(图c)。此外,与RNA杂交的DNA中的dU也可以被UDG切除,形成AP位点,与CCVJ-1反应后,荧光信号增强(图c)。接下来,研究人员测试了原位DNA合成及标记的连续过程。寡核苷酸ODN含有9dA,在引物、dUTPDNA聚合酶(Kf)存在下,可完成DNA合成。DNA合成、碱基切除、荧光标记三个过程同时进行的过程中进行荧光检测,发现538nm出的荧光逐渐增强(图d)。此外,这种原位DNA合成和BETr标记也适用于以RNA为模板的逆转录过程(图e)。研究人员进一步探索了DNA原位合成和BETr标记方法对从细胞内提取的dsDNA的潜在应用。他们HEK293T细胞中提取的基因组DNA (gDNA)进行缺口平移和原位BETr标记(f),所有反应在一个试管中同时进行(g),实时荧光增强,并报告反应进程。使用100% dUTP代替dTTP可以产生最强的荧光信号,这意味着gDNAdA对面的所有位点都被UBER标记(1h)。不含dUTP的对照组实验的荧光增强可以忽略不计,表明gDNA中内源性AP位点和dU的水平足够低,产生的背景信号小。

原位DNA合成和BETr标记的机理研究

研究人员使用具有不同腺嘌呤数目的模板DNA,研究了DNA中标记位点的相对数量和位置对荧光增强程度和标记效率的影响。在60 mer的模板链中引入2-11dA,随后引入聚合酶,并进行BETr标记(图a)。虽然随着dA数目的增多荧光信号增强(dA2-9),但引入11dA后,荧光信号强度略有减弱。研究人员推测荧光强度降低可能有三个原因:(i)临近标记对UDG的抑制作用;(ii)相邻染料之间的自猝灭作用,以及(iii)高密度荧光团的引入使双链结构不稳定。他们通过实验验证临近标记对UDG没有抑制作用。为了评估染料的猝灭效果,研究人员制备了含有1-3个连续dU或在不同距离含有两个dUdsDNA(b)并进行标记。当连续引入染料时,染料越多荧光强度越低,这意味着染料存在近距离自猝灭现象(b中的红色箭头)。接下来他们测试两个染料之间距离对荧光信号的影响,结果表明两个碱基对之间几乎很少或没有自猝灭现象(b中的蓝色箭头)

研究人员评估了原位DNA合成和BETr标记在ODNs上更密集荧光标记的适用性(c),测试了在引物结合位点旁编码1-5个连续标记位点(1A-5A)ODNs。他们发现模板中连续的dA并不会阻止聚合酶/BETr的成功标记。然而,随着染料数量的增加,强度略有下降,可能是由于自猝灭和局部DNA不稳定造成的。他们还测试了DNA链末端的BETr标记效率,因为碱基切除位点旁侧碱基对的数量显著影响糖基酶的活性(2d)。当碱基切除位点距离末端超过2nt时,UDGCCVJ-1标记荧光信号增强,这意味着UDG至少需要两个侧翼碱基在碱基切除位点后边。

位点特异性的双色标记

为进行多色标记,研究人员开发了UBER Red,与CCVJ-1共用,可实现双色标记(图a)。UBER RedAP位点反应后,荧光信号增强15倍。他们准备了发夹形ODN (dU/dI),在stem中有两种脱碱基位点(dU/dI),dU UDG底物,dI脱氧肌苷是N-甲基嘌呤DNA糖苷酶(MPG)的底物(图b)。将MPG添加到hairpin ODN中,可成功地用UBER Green (CCVJ-1)对其进行标记,用仅含dUhairpin ODN进行对照实验证实dI切除的特异性(c)UBER Red通过BETr的标记可进行红色荧光标记,绿色通道的重叠可以忽略不计。因此实验结果表明UBER RedUBER Green可实现双重标记。

在序列特异性的靶标核酸上进行DNA标记

研究人员设想,在互补的目标DNARNA上选择性地合成荧光标记的DNA,可以应用于检测混合物中的核酸,以及在生物学背景下原位合成FISH探针,并无需清洗步骤(d)。为了验证这一点,将541-60 ntspectator DNA与一个特定的目标DNA (60nt)混合,然后用目标特异性引物进行聚合酶/BETr原位标记(图e)。荧光分析显示,缺乏引物互补的spectator DNA引发的共价标记可以忽略不计,而目标DNA的荧光信号则随着时间的推移逐渐增强,表明荧光标记DNA序列的特异性合成。琼脂糖凝胶电泳分析进一步证实,只有在目标DNA存在的情况下才能进行UBER的原位共价标记(3f)

等温扩增的荧光信号报告

等温滚环扩增技术(Isothermal rolling circle amplification, RCA)可快速生成环状DNA的长链拷贝,广泛应用于生物分子目标检测和扩增。考虑到短的DNA引物(10-15 nt)可以被聚合酶扩展为很长的DNA(12,000 nt),他们设想耦合许多dU并进行BETr标记,可提供高亮度的长标记DNA。为此,他们使用了长度约7200 ntM13mp18环状ssDNA。考虑到连续腺嘌呤位点的存在会阻碍环状DNA中的荧光增强,他们设想使用dUTPdTTP的混合物来增加标记的平均间距。当反应中同时提供dUTPdTTP时,最终荧光的差异表明dUTPdTTP相互竞争,dUTP作为聚合酶底物的效率接近dTTP(a)。有趣的是,50%dUTP产生了~ 75%的荧光增强。这促使他们用不同的dUTP/dTTP比例进行原位RCABETr标记,以优化高效荧光标记的比例(4b)。在扩增开始(100min) dUTP比例越高,荧光增强越明显,意味着掺入和标记越快。然而,低比例(2%) dUTP在较长的反应时间内表现出更高的荧光增强。

高强度多标记的DNA结构

DNA纳米结构已经对纳米科学和技术产生了重要的影响。能够在DNA纳米结构3D组装后直接标记的方法具有巨大的潜力,dU取代dT提供了完全规范的碱基对,避免了对杂交和DNA组装的干扰。为了测试BETrDNA组装的标记能力,他们测试了对四面体DNA (TD)纳米结构的标记。TDs结构紧凑稳定,通过简单的自组装形成,并表现出抗核酸酶降解。每17 bp边缘包含一个dU(6)TD4ssDNA组装而成,其中一个通过杂交扩展到结构之外作为拴系位点(c)。组装TDBETr标记比每个ssDNA组分产生强的荧光强信号(c),证实了刚性结构的荧光优势。接下来他们将荧光标记的TD结构应用于成像分析。应激颗粒是细胞质中由mRNARNA结合蛋白组成的相分离聚集物,通常使用蛋白G3BP1作为应激颗粒的成像靶标。他们用G3BP1一抗偶联寡核苷酸监测了HeLa细胞中应激颗粒的形成。亚砷酸钠处理细胞30 min诱导应激颗粒形成,并用TD标记的G3BP1蛋白一抗(d)与抗体偶联寡核苷酸杂交直接观察。这使得在没有二抗的情况下可以清晰地观察细胞中的应激颗粒,这可以减少多分析物成像中的潜在交叉反应。  

目标DNATurnover 检测

研究人员发现MPG只能识别dsDNA中的DNA损伤,而不能识别ssDNA中的DNA损伤。基于此,他们设计了一种具有Turnover潜能的DNA检测系统(a)。在该检测系统中,在链的中心设计了一个含有MPG底物dIDNA探针,用于与目标DNA杂交。在缺乏靶标DNA的情况下,探针本身作为MPG的底物的性能非常差,因为它是单链的,不能产生荧光信号的增强(5b)

通过准备错配位置与标记位点相差1-4 nt的错配DNA,研究人员进一步测试了该策略对单碱基错配的识别。与标记位点相差1 nt2 nt的单错配DNA没有荧光信号的增强,因此该策略具有很高的特异性(c)Turnover检测系统可用于在此范围内区分单核苷酸多态性。

考虑到染料标记使DNA双链不稳定,具有优化长度的DNA探针应该是既要足够长以形成半稳定的双链,可作为MPG的底物,但又足够短以在染料标记后使双链不稳定解离(a)。为此,研究人员设计了7-11mer的含dI的探针链,测试它们随时间的荧光变化(图d)结果表明,在37°C时,7-mer链太短而不能作为底物,而11-mer链表现出强的MPG活性及明显的荧光信号增强。为了评估Turnover检测系统设计的应用,研究人员观测了探针链(11mer DNA)与目标DNA在不同比例时的荧光信号(e)。结果表明,一个拷贝的目标DNA可以标记多个拷贝的探针ODN。在较低的10 nM目标DNA浓度(0.5 picomole)下的测试表明,5个单位的MPG在这种条件下促进探针ODN的大约2000倍翻转(f),产生极强的放大信号。

总结:

在该工作中,研究人员开发了一种通过碱基切除诱捕荧光标记寡核苷酸的一般方法。将错配碱基切除后,产生脱碱基AP位点,利用设计的染料捕获该位点并进行标记,产生荧光信号。该策略无需清洗即可原位标记,可进行双色标记,gDNA检测,等温扩增检测,核苷酸特异性Turnover检测,并可以通过偶联到抗体成像蛋白等。

 

Jun, Y. W., Harcourt, E. M., Xiao, L., Wilson, D. L., Kool, E. T. Efficient DNA fluorescence labeling via base excision trapping. Nature communications, 2022, 13(1), 1-10.

2022年12月14日 17:05
浏览量:0
收藏