Nat. Struct. Mol. Biol. | 特殊的RNA G-四链体结构介导基因沉默

今天分享的是近期发表在Nat. Struct. Mol. Biol.上的一篇文章，标题为An atypical RNA quadruplex marks RNAs as vectors for gene silencing。

有关作者：

本文的通讯作者为University of Wisconsin–Madison的Samuel E. Butcher和Harvard Medical School的Scott G. Kennedy，两位教授的研究方向为RNA对基因表达的调节机制。

研究背景：

RNA是一种能够传递遗传信息、组装大分子机器、结合配体和催化化学反应的多功能生物大分子。转录后的共价修饰在RNA功能调控中发挥了极为重要的作用。线虫RDE-3是一种核苷酸转移酶，能在转座子RNA或者待降解的RNA的3′端加上UG二核苷酸重复序列（“pUG尾巴”）。pUG尾巴随后招募RNA聚合酶，引导小干扰RNA（small interfering RNA）的合成并切割目标RNA，最终导致基因沉默。RNA的生物功能多依赖于特定的结构。因此，本文探究了pUG尾巴结构与生物学功能的关系。

结果与讨论：

在线虫精子中，含有不少于14个UG重复单元的pUG尾巴能够诱导基因沉默，而含有8个重复单元的pUG尾巴则不具有生物活性。为了研究pUG尾巴功能与序列长度的关系，作者将一系列含有不同长度pUG尾巴的oma-1 RNA注射至线虫精子，比较其对一胚胎致死基因的沉默能力。他们发现当UG重复数目大于等于11.5时，pUG尾巴表现出基因沉默活性（图1a）。作者进一步从圆二色谱分析不同长度pUG尾巴的结构特征，发现当重复数目大于等于11.5时，pUG序列表现出平行G-四链体（parallel G-quadruplex）的特征信号（图1b）。与经典平行G-四链体相比，pUG在304 nm处呈现负峰（图1c）。将pUG尾巴的UG重复序列替换为其他G-四链体序列（GGGUAA或者GGGGCC）后，基因沉默活性消失（图1d）。上述事实表明pUG尾巴通过形成特殊的G-四链体结构发挥功能。

图1. pUG 尾巴的长度决定其结构和功能。

        作者随后通过核磁共振波谱实验和X射线晶体衍射解析了(GU)₁₂序列的结构。在一维氢谱11.5 ppm左右能观察到12个鸟嘌呤的H1信号（图2a），与G四链体相符。作者通过对二维NOESY、COSY、HSQC以及TOCSY谱的分析建立了该G-四链体中三层G-四分体（G-quartet）的结构（图2b-d），揭示了pUG尾巴至少需要12个鸟嘌呤才能形成G-四链体，该数目与发挥基因沉默功能所要求的最短UG序列长度相符。

图2. (GU)₁₂序列形成的G-四链体中三个G-四分体的核磁解析。

        N-methyl mesoporphyrin IX (NMM)是一种结合平行G-四链体的小分子配体。作者将(GU)₁₂序列与NMM共同结晶得到高分辨率结构（图3）。从上往下看，该结构分为五层：NMM堆积在顶层的G1-G7-G13-G19四分体上，U2、U8、U14和U20向外突起，使得G3-G9-G15-G21堆积在G1-G7-G13-G19四分体下，随后是G5-G11-G17-G23和U4-U10-U16-U22四分体。值得注意的是，在这个G-四链体中，U4之后磷酸骨架急剧转弯，使得G5所在的四分体堆积在G3和U4的四分体之间（图3g）。此外，由pUG尾巴形成的G-四链体整体上呈左手螺旋状（图4），G3和G5的糖苷键扭转角分别为syn和anti，与Z-RNA中的堆积方式类似（图4e-f）。G1与G3两个syn构象的核苷酸堆积被认为与304 nm的圆二色信号相关。

图3. (GU)₁₂-NMM复合物的晶体结构。

图4.左手螺旋的pUG RNA（左图）与右手螺旋的TERRA（右图）的比较。

随后作者探究了pUG G-四链体与其基因沉默功能的关系。他们将NMM预处理的oma-1 pUG RNA注射到线虫精子，发现NMM的剂量越高，pUG的基因沉默活性越低，而NMM本身并不影响基因沉默（图5a-b）。此外，他们也用不能形成G-四链体的7-deaza-G取代oma-1 pUG RNA的鸟嘌呤，发现取代后的pUG丧失了基因沉默的功能（图5c-d）。上述实验表明，pUG通过形成G-四链体而获得基因沉默活性。

图5. NMM结合、7-deaza-G取代阻碍了pUG基因沉默的功能。

    对RNA聚合酶的招募是pUG尾巴发挥基因沉默功能的第一步，因此，作者进一步探究了pUG G-四链体与RNA聚合酶RRF-1的相互作用。他们发现native pUG序列可以将RRF-1 pulldown，但NMM结合、7-deaza-G取代均阻碍了pUG序列与RRF-1之间的相互作用（图6），表明pUG通过形成G-四链体招募RNA聚合酶。

图6. NMM结合、7-deaza-G取代阻碍了pUG与RNA聚合酶RRF-1的相互作用。

总结与展望：

        本文从线虫基因中UG二核苷酸修饰长度与功能的关系出发，揭示了pUG序列通过折叠成特殊的G-四链体结构招募RNA聚合酶、行使基因沉默功能。GT/AC是哺乳动物基因组中最常见的微卫星重复序列，其转录形成的UG重复序列的结构和功能有待进一步探究。

Roschdi, S., Yan, J., Nomura, Y. et al. An atypical RNA quadruplex marks RNAs as vectors for gene silencing. Nat Struct Mol Biol 29, 1113–1121 (2022). https://doi.org/10.1038/s41594-022-00854-z