PNAS丨可靶向RNA三级结构的小分子
大家好，今天给大家分享的文献为2022年10月发表在PNAS上的《 Discovery of small molecules that target a tertiary-structured RNA》, 通讯作者是来自索尔克研究所的Gerald F. Joyce教授和来自Radial Therapeutics的Jeff Rogers教授。其中Gerald F. Joyce教授是体外进化领域的先驱，其主要方向是利用体外进化尝试在试管中重建早期生命的生物分子，从而更好地帮助人们理解生命的起源与进化。
Gerald F. Joyce
近年来，人们对开发新型小分子来靶向疾病相关RNA越来越感兴趣，并在可靶向RNA小分子的发现方面取得了一些成功，但是对于这些小分子/RNA结构-活性之间的关系一直缺乏有效的理解。茶碱RNA适体是一种能够以高亲和力和高选择性结合茶碱分子的核酸适体，茶碱RNA适体/茶碱复合物的核磁共振结构已于25年前被确定，但是迄今为止，没有任何关于茶碱适体的X射线晶体结构被报道，也没有发现任何其他配体与该适体的结合比茶碱更紧密。
在本文中，作者使用低分子量化合物文库进行高通量筛选，发现了几种独特的化合物，这些化合物在化学结构上与茶碱不同，但与茶碱适体结合的亲和力最高高达茶碱的340倍。为了更好地理解小分子与茶碱RNA适体结合的分子结构基础，作者通过X射线晶体衍射解析了茶碱适体本身及与小分子结合后复合物的晶体结构，这在之前是没有被报道过的。该结构揭示了RNA适体如何通过多种相互依赖的组分形成刚性配体结合口袋，从而使茶碱能够以亚微摩尔亲和力结合茶碱RNA适体。
具体而言，作者首先开发了一种链侵入( Strand Invasion )的测定方法，对含有大约100万个小分子（< 600 Da）的文库进行高通量筛选。该小分子文库已被常规地应用于筛选各种蛋白质靶标和药物发现。本研究中使用的链侵入测定采用了两种策略：第一种是在适体上修饰荧光基团并在与适体部分互补的寡核苷酸链上修饰猝灭基团（图1A）。第二种是适体上分别修饰荧光和猝灭基团，部分互补链上不修饰。通过将适体与文库中的小分子一起孵育，然后加入与适体部分互补的寡核苷酸链，通过荧光强度变化判断小分子与适体结合的紧密程度，并将实验中的IC50值视为二者结合Kd的估计值，由此筛选出与适体结合的小分子。作者通过对之前已经研究报道过的茶碱及7个茶碱类似物进行研究来验证链侵入实验的可行性。结果表明，8种化合物的IC50值与之前报道的Kd值几乎一致，证明了该实验的科学性与可行性（图1B）。
图1 链侵入测定以筛选结合茶碱适体的小分子化合物
接下来，作者从包含1107541的小分子文库中筛选得到10742个小分子。然后将这10742个小分子在不同浓度下进行反筛，获得153个小分子。最后，作者对这153个小分子进行剂量反应试验获得IC50值。结果发现其中46种化合物的IC50值都低于茶碱，而作者重点关注了其中的4个化合物TAL1、TAL2、TAL3和TAL4。这四个化合物相较于茶碱的六元环并五元环体系，都含有六元环并六元环体系（图2）。其中TAL1是氨基和甲基取代的蝶啶酮，与茶碱的分子量最相近。之后作者通过表面等离子体共振实验法测定茶碱及四种化合物与茶碱适体的结合亲和力。茶碱的Kd值为0.67 μM，与之前报道的值非常一致。四种化合物的Kd值分别为0.0020、0.0091、0.023和0.28 μM。这些值反映了TAL1是与适体结合最紧密的配体，其Kd值比茶碱低了340倍。
图2 茶碱和高通量筛选获得的四种化合物的化学结构及Kd值
为了使这些发现合理化并更好地了解与适体结合的小分子结构基础，作者测定了RNA适体本身及其与每种小分子结合后的晶体结构特征。由于适体本身的初始结晶实验没有成功，作者使用了两种策略来获得稳定的单晶结构：第一种为用AAACA五环替换适体的GAAA四环，其中五环结构与和RNA共结晶的抗体的抗原结合片段( Fab )紧密结合。第二种为用G-C Watson-Crick碱基对替换茎底部的G2-U32摆动对，从而获得相对稳定的茎。
使用Fab共结晶策略，在1.81 Å的分辨率下解析RNA适体的结构。发现该RNA以两种构象存在，每种构象都形成一个延伸的发夹状结构，大多数残基呈堆叠排列，并且明显缺少茶碱结合口袋（图3A）。而与配体结合后，构象明显发生了变化（图3B）。接下来，用适配体TAL2浸泡载脂蛋白晶体，为了揭示RNA-配体相互作用的原子级细节，有必要转向第二种结晶策略即稳定的适配体茎和无蛋白质成分，以2.46 Å分辨率解析复合物的结构（图3C）。
图3 茶碱适体结合配体前后的X射线晶体结构
该结构揭示了TAL2的4-羟基喹唑啉如何依偎在茶碱结合口袋中，与C22的N3和环外胺以及U24的N3形成氢键相互作用（图4A和B）。C22-TAL2-U24组成碱基三联体，在U6-U23-A28和A7-C8-G26组成的三联体之间，这和RNA适体与茶碱结合的模式相同。同时，二者有一个显著的差异，TAL2的甲氧基和烷基哌啶基团暴露在溶剂中，这些取代基在晶体结构中没有很好地分离，似乎不与适体直接接触，但可能通过构象动力学或溶剂化影响熵对结合自由能的贡献。当茶碱或TAL2被束缚在结合口袋中时，堆叠能量也可能存在细微差异。这些可能是该化合物与茶碱相比亲和力显著增强的原因。
图4 茶碱适体与不同配体结合后的晶体结构
TAL2配体的喹唑啉酮占据RNA适体中茶碱结合位点的方式与茶碱在先前报道的NMR结构和此处报告的晶体结构中的结合方式高度相似。在这两种情况下，C27都从延伸的发夹中翻转出来，使残基C22、U23和U24形成S形弯的一部分，并形成构成茶碱结合位点中心的堆叠的碱基三联体。这种排列与无配体结构形成鲜明对比，其中结合口袋坍塌，C27堆叠在G26和A28之间。茶碱和TAL2都与C22和U24形成碱基三联体，不同的是，茶碱的五元环和六元环都与两个碱基结合，而对于TAL2，只有六元环中的一个与之相结合。
二价金属离子（Mg2+，Mn2+或 Co2+）是茶碱与适配体结合所必需的。将顺磁性Mn2+滴定到含有Mg2+配合物中的核磁共振研究表明，存在一种位于S型弯的C22、U23和U24残基附近的特定结合金属。适体-茶碱配合物的X射线晶体结构揭示了Mg2+（绿色球）与G25的N7结合并与五个水分子配位，从而稳定形成配体结合位点的S形弯（图4C）。两个Na+（蓝色和紫色球）有助于稳定这种结构：其中一个与A5的N7、U6的O4和C22的2’-OH相互作用;另一个与U23的O2和2’-OH配位，并与U24的糖-磷酸和A28的磷酸形成水介导的氢键相互作用。
继续解析其他三种配体与茶碱适体结合复合物的晶体结构。从筛选中得到的亲和力最高的配体是TAL1，该化合物以与茶碱和TAL2类似的方式与适体结合，但与RNA形成两个额外的氢键（图4C）。除了与C22的N3和环外胺作用外，还与C22的O2产生相互作用。除了与U24的N3相互作用，还与O2产生相互作用。为了将TAL1容纳在结合口袋内，U24与茶碱结合复合物中的方向相比向外旋转0.7 Å。TAL3在化学上与TAL2非常相似，并且与适配体结合相似（图4E）。作者认为TAL3的亲和力比TAL2低2.5倍主要是由于解离速率的差异。TAL4与其他喹唑啉酮更不同，对适配体的亲和力低10-30倍，但仍比茶碱高。晶体结构显示，TAL4也结合在茶碱口袋中，但仅与U24的N3形成一个氢键（图4F）。尽管如此，TAL4的形状互补性非常好，形成了关键的堆叠相互作用。
总之，本项研究通过高通量筛选寻找能靶向茶碱适体的小分子配体。发现了比茶碱与茶碱适体结合更紧密的小分子化合物，它们与茶碱适体的结合力是茶碱的2~340倍。研究还确定了该适体的X射线晶体结构，揭示了配体结合的分子基础，从而为靶向疾病相关RNA的小分子药物开发研究奠定了基础。
