JACS丨RNA聚焦的DNA编码文库的研究揭示了一个r（CUG）重复扩增降解器的设计

大家好，今天分享一篇近期发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，题目是Study of an RNA-Focused DNA-Encoded Library Informs Design of a Degrader of a r(CUG) Repeat Expansion。本文的通讯作者是来自佛罗里达大学斯克里普斯生物医学研究所化学系的Matthew D. Disney教授，他的主要研究方向包括基于序列的跨人类转录组药物设计，提供精确的先导药物；通过募集细胞核酸酶以催化和亚化学计量方式对RNA进行降解（RIBOTACS）等。

在中心法则中，RNA是连接DNA与蛋白质的桥梁，开发RNA靶向疗法可以大幅扩大人类基因组中可用于治疗靶点的比例，潜在的RNA靶点包括与疾病相关的mRNA和非编码RNA等。营养不良肌紧张性蛋白激酶（DMPK）mRNA的3′非翻译区（UTR）中有一段大于50个r(CUG)重复单元的RNA序列，即r(CUG)^exp。r(CUG)^exp会折叠成茎部含有U·U内环的发夹结构，结合并隔离肌盲样1蛋白（MBNL1），该蛋白是一种RNA剪切调节器。r(CUG)^exp-MBNL1相互作用形成核灶，减少r(CUG) mRNA运输到细胞质并使MBNL1丧失功能，导致pre-mRNA剪接缺陷（图1A- C）。本文中，作者利用DNA编码库（DNA-encoded library, DEL）筛选到靶向结合r(CUG)^exp的小分子化合物（图1D），并建立一个新的平台来识别靶向疾病相关RNA的先导分子。

图1 r(CUG)^exp结合MBNL1导致DM1疾病中的pre-mRNA剪切缺陷以及靶向降解r(CUG)^exp的小分子设计。

首先，作者构建了一个RNA聚焦的固相DEL，该文库富含RNA结合物中常见的小分子，包括富含固氮的杂环和具有额外氢键供体和受体的化合物。选择Fmoc保护氨基酸进行前两个化学构件偶联（分别为BB1和BB2），22个富氮杂环化合物用于最终的化学循环（BB3）。接下来用Cy5-r(CUG)₁₂和Alexa750-r(GC)₈对照筛选DEL（图2A）。DEL同时孵化Cy5-r(CUG)₁₂和Alexa750-r(GC)₈，通过双色荧光激活细胞分选进行分析发现珠子均选择性地结合Cy5-r(CUG)₁₂（图2B, C）。每种命中珠子上的DNA标签都用一个独特的指数进行扩增，并通过下一代测序技术进行分析。结果显示与每个索引中的70、302和217个命中点相关，其中23种化合物存在于三种类型中（图2D）。这23种化合物被认为是高可信度的RNA结合物。对三个命中池的构建块频率分析显示，构建块BB1−07、BB1−20、BB2−20和BB3−03富集（图2E）。

图2 针对r(CUG)₁₂的DEL珠子的筛选和解码。

作者据此合成了16个命中化合物，并对r(CUG) mRNA的核质运输进行了评估（图3A）。使用稳定表达荧光素酶报告基因的C2C12细胞，将报告基因与含有r(CUG)₈₀₀的3′UTR或r(CUG)₀的对照基因融合。由于r(CUG)₈₀₀被隔离在细胞核中，与r(CUG)₀相比，荧光素酶的数量明显减少。在研究的16种化合物中，化合物1最大程度地增加了表达r(CUG)₈₀₀细胞的发光，而不影响表达r(CUG)₀对照细胞的发光（图3A, B）。此外，化合物1剂量依赖性地挽救了核质转运缺陷（图3C）。1的对映体在荧光素酶实验中是不活跃的，表明手性在化合物与r(CUG)^exp的相互作用中起重要作用。

图3 表型筛选结果显示化合物1减轻DM1细胞模型中的核质运输缺陷。

接着研究了1的两个衍生物：DEL1和DEL1-CLIP（图4A）。采用微尺度热电泳测定了两者对Cy5-r(CUG)₁₂的亲和度，均观察到饱和结合。重要的是，U·U内环被A-U碱基对取代时没有观察到化合物与RNA的结合，DEL1的对映体也没有与RNA结合。利用Chem-CLIP进一步研究了靶点的参与情况。当RNA与DEL1-CLIP孵育时，观察到与放射性信号显著富集；对照CLIP探针未观察到富集，证实了小分子与RNA靶点的相互作用（图4B）。

为了研究DEL1本身，在DEL1-CLIP和DEL1之间进行了竞争性的Chem-CLIP检测。在本实验中，³²P-r(CUG)₁₀与DEL1-CLIP和DEL1共孵育。在100 μM和200 μM时，观察到与珠子相关的放射性信号的剂量依赖性减少，表明这两种化合物结合在同一个位点（图4C）。使用Chem-CLIP验证r(CUG)^exp作为DM1患者中DEL1来源肌管的靶点，在DM1肌管中观察到DMPK mRNA富集，在来自WT的肌管或使用对照Chem-CLIP探针处理的DM1肌管中未观察到富集（图4D）。这些结果支持DEL1在DM1患者来源的细胞中结合长重复r(CUG)^exp，而不与短重复r(CUG)结合。

图4 DEL1的体外和细胞靶点参与。

研究人员在DM1患者来源和WT肌管中评估DEL1的生物活性。在DM1和WT细胞中，DMPK的丰度不受DEL1的影响（图5A）。在DM1肌管中，由MBNL1被隔离引起的MBNL1第5外显子的异常剪接被DEL1适度挽救。通过RT-qPCR检测，在DEL1 5 μM时观察到第5外显子的减少有统计学意义（图5B）。此外，在WT肌管中没有观察到对这种选择性剪接事件的影响，这进一步支持了结合物对突变等位基因的特异性。同时，DEL1也减少了DM1肌管中的核病灶数量。

图5 DM1肌管中DEL1 r(CUG)^exp结合物的细胞活性。

为了提高DEL1的活性，作者合成了一种可以结合并切割r(CUG)^exp的衍生物DEL1-Bleo，它是通过将DEL1的末端胺与博莱霉素A5连接而合成的（图6A）。DEL1-Bleo的结合亲和力分别是DEL1和DEL1-CLIP的6倍和3倍。通过凝胶电泳评价了DEL1-Bleo在体外切割放射性标记的r(CUG)₁₀的能力，观察到RNA的剂量依赖性的裂解，在测试的最高浓度下约有60%的RNA裂解。在患者来源的肌管中，通过RT-qPCR检测，剂量依赖性地将DMPK转录水平大约降低了25%（图6B）。博莱霉素A5对DM1肌管中DMPK转录本丰度没有影响。首先，作者评估了非致病重复序列的转录本是否被剪切。通过RT-qPCR对它们的丰度进行定量分析显示，与针对r(CUG)重复序列的反义寡核苷酸相比，它们不受DEL1-Bleo处理的影响。其次，在HeLa细胞稳定表达的细胞模型中评估DEL1- Bleo对扩增等位基因的特异性，DEL1-Bleo选择性地和剂量依赖性地降低了r(CUG)₄₈₀的丰度，而对r(CUG)₀的水平没有影响（图6C）。最后，DEL1-Bleo对WT肌管中的DMPK转录水平没有影响（图6D）。

DEL1-Bleo也可以缓解DM1相关的缺陷，包括异常的选择性剪接和核灶的形成。在DM1患者来源的肌管中，DEL1-Bleo挽救了MBNL1第5外显子的异常剪接。观察到剪接缺陷的剂量依赖性改善，在5 μM剂量下，大约使第5外显子内含物减少了40%（图6E）。同样，其他MBNL1调控的mRNA也被DEL1-Bleo改善，包括MBNL1第7外显子和NCOR2第45a外显子。重要的是，DEL1- Bleo并不影响NOVA调控的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）第22a外显子的选择性剪接，也不影响WT肌管中MBNL1第5外显子的选择性剪接（图6F）。

图6 肌管中DEL1-Bleo r(CUG)^exp降解剂的细胞活性和选择性。

本文利用DEL技术成功鉴定了选择性结合r(CUG)^exp的小分子结合物。化合物1可通过结合DMPK mRNA中的r(CUG)^exp，选择性地改善与DM1相关的翻译缺陷，其分子识别受化合物的手性控制。1的衍生物DEL1-Bleo诱导了致病性转录本的选择性切割，并改善DM1细胞表型。该研究建立了一种新的平台和技术来识别靶向疾病相关RNA的先导分子。