SCIENCE丨利用镜像T7转录制备镜像核糖体RNA及功能性RNA
大家好，今天与大家分享一篇近期发表在Science上的文献，题目为Mirror-image T7 transcription of chirally inverted ribosomal and functional RNAs，通讯作者是来自西湖大学的朱听教授。朱听教授课题组的主要研究方向包括：镜像生物学，合成生物学以及化学生物学等。
构成生命的天然核酸和天然蛋白质皆具有手性单一特性：已知的天然核酸皆由D型核糖组成，天然蛋白质几乎皆由L型氨基酸组成。构建镜像蛋白质翻译系统的关键在于合成镜像核糖体。核糖体RNA是核糖体的结构与催化核心构成镜像核糖体的结构和催化核心的、千碱基长的镜像核糖体RNA。然而受限于已有的技术，此前能获取的最长镜像RNA仅有120 nt，远不足以实现制备长链镜像RNA的目标。
图1. 天然手性和镜像T7 RNA聚合酶的合成。
本文中，作者通过化学合成获得了100 kDa的镜像T7 RNA聚合酶，它能够以酶促合成的长镜像DNA基因为模板，高效而保真地转录产生全长的镜像5S、16S和23S核糖体RNA。作者还探究了该镜像T7转录系统的实际应用，制备了具有强生物稳定性的镜像核糖开关用作传感器，实现了无保护的、千碱基长的L-RNA在水中的长期储存，以及L-核酶催化的L-RNA聚合。
为突破全化学合成对蛋白质大小的限制，作者利用分割蛋白质（split protein）的策略，将全长为883个氨基酸的T7 RNA聚合酶分割成长度分别为363、238和282个氨基酸的三个片段进行合成，并将其在体外共同复性，使其正确折叠成具有完整功能的100 kDa高保真镜像T7 RNA聚合酶（图1B）。随后，作者通过全化学合成和连接，分别获得了天然手性和镜像T7 RNA聚合酶的对应片段，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析和鉴定（图1C）。
图2. 通过镜像T7 RNA聚合酶转录并纯化镜像核糖体RNA
为测试合成的镜像T7 RNA聚合酶的转录活性，作者采用镜像PCR获得的、编码嗜热栖热菌（T. thermophilus）5S rRNA的双链L-DNA作为模板测试了该镜像T7 RNA聚合酶的转录活性，并发现其能够转录出全长122 nt的镜像5S rRNA（图2A）。通过对转录的镜像5S rRNA产物进行凝胶纯化并通过核糖核酸酶A（RNase A）处理后，发现其具有抗天然RNase A降解的能力（图2B）。作者随后利用镜像T7 RNA聚合酶转录、并纯化了90 nt的镜像tRNASer，发现其对天然RNase A的降解同样具有抗性（图2C）。此外，作者采用46 nt的镜像核酶（dFx）将D-Ser-3,5-二硝基苄基酯（D-Ser-3,5-dinitrobenzyl ester, Ser-DBE）装载到了镜像tRNASer上，且该核酶的氨酰化产率与天然手性版本相似（图2D）。
图3. 千碱基长的镜像rRNA的镜像T7转录和纯化
作者进一步测试了该镜像聚合酶转录长L-RNA片段的能力。利用该镜像聚合酶，分别转录获得了长1.5-kb的全长镜像16S和长2.9-kb的全长镜像23S rRNA（图3，A和B）。同时，作者还通过合成的天然手性T7 RNA聚合酶转录获得了天然手性rRNA（图3，A和B）。与天然手性rRNA相比，镜像5S、16S和23S rRNA具有更强的抗酶降解稳定性（图3C），这一结果也预测镜像核糖体的组装（图3D）在实验上比天然手性版本更容易。
图4. 镜像核糖开关传感器。
为了探索镜像T7转录系统的实际应用，作者根据先前报道的设计，将镜像鸟嘌呤适体与镜像“菠菜适体”（Spinach）融合，开发了长130 nt的镜像核糖开关传感器（图4A）。由于鸟嘌呤和Spinach适体的小分子靶标（DFHBI荧光团）都是非手性的，因此天然手性和镜像核糖开关传感器有望表现出相同的结合特性。作者发现，由合成镜像T7 RNA聚合酶转录、凝胶回收纯化的130 nt镜像核糖开关传感器对天然RNase A降解具有抗性（图4B）。此外，当与相同浓度的鸟嘌呤孵育时，天然手性和镜像核糖开关传感器表现出了几乎相同的荧光强度，而作者均未检测到天然手性与镜像核糖传感器与相同浓度的D-或L-三磷酸鸟苷（GTP）和腺嘌呤之间的非特异性结合（图4C）。在稳定性方面，作者在预设的“无RNase”条件下，即在37°C下用DEPC水和无RNase试剂配制的缓冲液中，对天然手性和镜像核糖开关传感器进行长期孵育后，观察到镜像核糖开关传感器显示出比天然手性传感器的估计半衰期都更长，不管后者使用RNase抑制剂与否（图4D）。
图5. 天然及镜像16S核糖体RNA在不同储存条件下的稳定性。
此外，作者还对镜像RNA在各种环境中的稳定性开展了系统性探究（图5）。将纯化后的长度为1.5 kb的天然及镜像16S核糖体RNA储存在经DEPC处理去除核糖核酸酶（RNase）的超纯水中，天然RNA在4小时后被完全降解（图5A）；即使在样品中添加RNase抑制剂，其48小时后也被完全降解（图5B）；而镜像RNA在30天后才被完全降解（图5C）。该实验说明经DEPC处理的超纯水仍存在微量RNase污染，但镜像RNA独特的生物稳定性使其不受RNase污染的影响。研究者还将天然及镜像16S核糖体RNA储存在取自于自然环境的荷塘水中进行测试。结果显示，无论是否添加RNase抑制剂，天然RNA在4小时后均被完全降解（图5D与5E），而镜像RNA在7天后才被完全降解（图5F）。因镜像RNA具有独特的生物稳定性，未来有望成为一种不受RNase污染影响的RNA研究模式系统。
图6. 镜像核酶催化的镜像RNA的聚合
生物稳定的L-RNA模型系统可能有助于核酶的体外研究，特别是对研究生命起源的研究，其中“RNA世界”假说的关键是核酶催化的RNA聚合。体外定向进化的RNA序列发现了多种聚合酶核酶，包括约180-nt的“24-3”和“38-6”聚合酶核酶，它们分别能够扩增短RNA序列和聚合97-nt的I类连接酶核酶。作者利用合成的镜像T7 RNA聚合酶（图6A-6C）和镜像PCR组装的双链L-DNA模板转录了编码I类连接酶核酶的镜像38-6聚合酶核酶和单链L-RNA模板。凝胶纯化的182 nt l-核酶和112 nt L-RNA模板均对天然RNase A的消化具有抗性（图6B与6C）。作者进一步尝试使用凝胶纯化的镜像38-6聚合酶核酶与5′-FAM-生物素标记的L-RNA引物，通过聚合获得镜像I类连接酶核酶。将该引物退火至凝胶纯化的L-RNA模板（图6A），并与L-核苷三磷酸（L-NTPs）在200 mM MgCl2，pH 8.3，17℃下孵育10天后，发现L-核酶催化L-RNA引物延伸至全长的效果与D-核酶相当（图6D）。此外，在2 mM Mg2+浓度下，L-核酶表现出了比天然版本更长的半衰期（图6E）。
综上，该研究报道了利用全化学合成的100 kDa高保真镜像T7 RNA聚合酶制备多种镜像RNA，包括不同镜像核糖体RNA及功能性RNA。该镜像T7转录系统有望被应用于诊断治疗、信息存储、分子计算、生物成像及RNA相关基础研究等领域。
