PNAS丨合成 T 细胞受体的 DNA 折纸Patterning揭示了信号激活的敏感性和动力学的空间控制
今天分享的文献为2021年9月发表在PNAS上的《DNA origami patterning of synthetic T cell receptors reveals spatial control of the sensitivity and kinetics of signal activation》,通讯作者是加州大学旧金山分校的Shawn M. Douglas和Ronald D. Vale.
配体的空间排列在调节细胞内的下游信号中起着关键作用。然而由于在精确排布配体方面的方法学限制，配体簇的空间分布与信号动力学之间的关系仍然知之甚少。通过开发用于配体排布的DNA“钉板”，作者证明了配体的纳米排列在调节T细胞的信号转导中起着重要作用。作者的研究发现配体聚类不仅影响信号触发的灵敏度，还决定了细胞内信号反应的时间动态。该方法可高度转化为研究各种信号通路，且这一工作的研究结果对治疗方法的开发提供了新的信息。具体研究内容如下：
DNA纳米钉板的设计如图1所示。在该研究中，纳米钉板表面分布的ssDNA用于模拟配体，作者前期工作开发的DNA-CARζ被用作细胞表面受体。DNA折纸钉板的尺寸约为60×60nm，高度为6nm（图1B），72个钉钉排列成6×12阵列，行和列的间距分别为7纳米或3.5纳米（图1B），这使得配体间间距可在38.5至3.5纳米范围能调节。全内反射荧光显微镜(TIRF)结果显示，单个DNA折纸颗粒在大小和强度方面也显示出相对均匀的成像，表明具有几乎没有聚集的均匀结构（图1E）。作者考察了折纸上的配体ssDNA是否能够结合受体ssDNA。结果表明携带配体ssDNA的DNA钉板确实能够招募受体，且募集的受体的数量与设计的每个DNA折纸的配体数量成线性比例。作者考察了T细胞表面的受体DNA是否对DNA折纸携带的配体有响应（图1E）。作者使用16bp的DNA作为配体，以提供高亲和力相互作用来模拟CART细胞免疫疗法中抗体结合结构域与其分子靶标的结合。DNA钉板通过链霉亲和素-生物素相互作用被固定在玻璃表面上，加入表达DNA-CARζ-GFP的Jurkat细胞来可视化分析受体聚集（图1A）。结果显示，DNA钉板确实能将DNA-CARζ-GFP募集到亚微米簇中（图1E）。每个DNA折纸颗粒募集的DNA-CARζ-GFP的数量与每个DNA钉板的配体数量成正比（图1F）。总之，这些结果表明DNA折纸可以微调T细胞表面上结合的配体-受体对的数量。随后作者考察了DNA钉板是否可以实现细胞内信号传输。TCR-pMHC相互作用导致TCR磷酸化，从而触发ZAP70的募集。作者使用72个配体的DNA钉板测试了这一概念。作者发现ZAP70-mScarlet被大量募集到DNA折纸粒子接合的DNA-CARζGFP微团簇中（图1H-J），且ZAP70在前2分钟内表现出高强度的募集，然后募集在接下来的约3分钟内降至峰值强度的25%至50%。
图1
为了测量DNA钉板对ERK的激活，作者设计了一种表达DNA-CARζ和激酶易位报告基因(KTR)的JurkatT细胞，能够在单个活细胞中以高灵敏度监测ERK活性。磷酸化后，该报告基因从细胞核输出到胞质，并在去磷酸化后返回细胞核（图2A）。12分钟后，作者在72配体DNA钉板刺激的33%细胞中观察到ERK-KTR易位，这与6%细胞停留在0配体DNA钉板表面的背景形成对比（图2B）。
作者设计了携带不同数量链的DNA钉板（图2C，上），并比较了它们在12分钟内在一系列折纸密度下触发ERK反应的概率（图2C，左下）.一个和两个配体DNA钉板无法触发ERK反应，该反应明显高于零配体DNA钉板控制，密度高达每平方微米两个折纸，即每个细胞约200个折纸。在相同的DNA钉板密度（每平方微米两个4配体DNA折纸）下，4配体DNA钉板显着增加了ERK激活的可能性（30%的细胞）。当以较低密度（每平方微米一个16和72个配体DNA折纸）呈现时，具有更高配体占有率的DNA钉板实现了类似的ERK激活概率。简而言之，每个DNA钉板的配体占有率增加会增加ERK触发灵敏度。
作者们思考是否通过配体总数或空间分布来控制它们的下游信号激活。作者通过根据跨细胞接触区域的配体总数重新绘制各种DNA钉板的剂量反应曲线来探索这个问题（图2C，右下角）。在相同的DNA配体密度（每平方微米2∼8个DNA配体）下，与两个或一个配体DNA钉板相比，4配体DNA钉板增加了ERK激活的可能性，表明配体聚集提高了ERK信号敏感性，随着每个簇的配体占有率进一步增加，它们在触发ERK反应方面变得不那么有效。当总配体密度保持不变（每平方米约10个配体）时，72个配体DNA钉板触发了10%的细胞，而16个或4个配体DNA钉板分别触发了20%和30%。总的来说，这些结果表明配体的空间排列改变了T细胞活化的阈值。与之前关于配体数量影响的数据一致，作者的结果表明局部配体密度的窗口很窄，这对受体信号传导是最佳的。
图2
单细胞KTR报告分析揭示了有关ERK信号的时间、振幅和细胞间变异的信息（图3A）。作者检查了T细胞中受各种配体模式刺激的ERK信号随时间的动态变化。在保持细胞接触区域的配体总数相同的条件下，作者通过改变每个折纸的配体的密度来考察配体簇大小对ERK信号传导的影响（图3B）。在每平方米约34至42个配体的条件下，相似比例(约42%)的细胞在96分钟的时间内被不同密度的（4、16或72）配体DNA钉板激活（图3C）)。细胞的ERK信号在相似的时间内被触发并达到相似的ERK信号幅度（图3D）。然而，值得注意的是，由72个配体DNA钉板刺激的ERK信号终止时间明显早于4个和16个配体DNA钉板。例如，只有10%的与72配体折纸共孵育的ERK激活细胞（占所有细胞的4%）在36分钟时仍保持ERK信号，而这一比例在4配体折纸的处理组中达到77%（图3C和D）。该实验表明配体模式影响ERK反应的持续时间。
图3
作者也研究了配体间距对激活ERK概率的影响。对于4配体单元，作者将配体设计为10nm（“紧密”）或40nm（“稀疏”）间距，并将这两个4配体折纸与具有相同总配体密度的单配体折纸进行了比较（图4A，上图）。在折纸密度变化的实验中，紧密型4配体折纸比稀疏型4配体折纸更有效（图4A，底部），而在相似的整体配体密度下，稀疏型4配体折纸仅比单配体折纸更有效。作者在相等的总配体密度下检查ERK信号传导的动力学时（图4B），他们发现紧密型4配体折纸比稀疏折纸有更快的ERK响应时间（图4C），尽管持续时间和ERK信号的幅度相似（图4D）。这些结果表明，更密集的配体堆积可以触发更快、更有效的ERK反应。
图4
当T细胞扫描物体表面时，抗原呈递细胞使用其生理性αβ-TCR，它在大量低亲和力的内源性肽-MHC中遇到少量高亲和力抗原肽-MHC。这一现象在肿瘤相关的抗原识别中尤其典型，这些抗原在肿瘤细胞表面的大量低亲和力内源肽中以极低水平表达（由于其抗原加工和呈递机制的缺陷）。目前有一些研究结果表明，低亲和力pMHC配体通过激动剂促进信号转导，而在其他实验条件下观察到这种低亲和力配体在T细胞活化中没有实质影响。在此，作者用他们的模型来探索当此类CAR-T细胞遇到肿瘤时弱配体相互作用是否能够促进信号。为了模拟低亲和力TCR结合，作者将配体链上杂交核苷酸的数量从16bp减少到11bp（图5A，上）。
作者设计构建了一个DNA钉板，其中心放置了4条高亲和力配体链（16bp），周围环绕着68条低亲和力配体链（11bp）（图5A）。为了排除额外的低亲和力配体可能通过粘附或其他方式共同增强信号的可能性，作者设置了一个对照组使其中高亲和力配体在空间上远离低亲和力配体DNA钉板（图5A，橙色框）。结果显示，4配体高亲和力DNA钉板和72配体低亲和力DNA钉板均不能触发ERK，而围绕了68个低亲和力配体的4个高亲和力配体设计提高了ERK激活的可能性（图5B），这表明协同效应需要在高、低亲和力配体在纳米尺度上毗邻。作者还比较了用具有或不具有周围低亲和力配体的4个高亲和力配体簇刺激的细胞中ERK信号传导的动力学（图5C，D）。这些结果表明，邻近的低亲和力配体使细胞对高亲和力配体的刺激更为敏感，但不会改变ERK反应的时间或幅度。
图5
