CELL RES丨CRISPR FISHer 能够通过相分离介导的信号放大对活细胞中的非重复 DNA 进行高灵敏度成像

大家好，今天分享的是于今年九月发表在Cell Research上题为“CRISPR FISHer enables high-sensitivity imaging of nonrepetitive DNA in living cells through phase separation-mediated signal amplification”的文献，通讯作者为西湖大学生命科学学院宋春青研究员和申恩志研究员。

活细胞中非重复序列的可视化仍然是巨大的挑战。本文介绍了一种强大的CRISPR介导的荧光原位杂交放大器系统（CRISPR FISHer），该系统利用工程化的sgRNA和蛋白质三聚体结构域介导的相分离信号放大策略，使得荧光蛋白在CRISPR靶向位点处呈指数组装，增强了靶点的局部亮度和信噪比，实现了活细胞中原生非重复DNA位点的可视化。

原理

CRISPR FISHer的设计基于工程sgRNA支架的使用。CRISPR FISHer体系除了核酸酶失活的dCas9外，还使用了带有两个PP7 RNA适体的sgRNA（sgRNA-2×PP7），来招募由PP7外壳蛋白（PCP）、绿色荧光蛋白（GFP）和一个T4纤原蛋白三聚体基序foldon组成的融合蛋白（称为foldon-GFP-PCP）。利用CRISPR FISHer，sgRNA支架可以在目标基因处招募大量融合荧光蛋白foldon-GFP-PCP，用于特异性成像。凝胶电泳证实，纯化的foldon-GFP-PCP可以形成可溶性的稳定三聚体（如图1a，b）。

为了确定三聚化基序foldon的加入是否能诱导foldon-GFP-PCP蛋白与带有PP7适体的sgRNA组装，作者将纯化的foldon-GFP-PCP和PCP-GFP分别与普通sgRNA或一系列含有1-8×PP7适体的sgRNA孵育。仅在含有foldon-GFP-PCP和2-8×PP7的sgRNAs时，观察到大量的小聚集体，这些聚集体在2-8×PP7的组间呈现出相似的密度（图1c，d）。以上结果表明，三聚体foldon-GFP-PCP和含有2-8×PP7的sgRNAs的相分离组装可能会呈指数增长，装配模型如图1e所示。由于折叠蛋白诱导聚合的能力，CRISPR FISHer具有增加活细胞sgRNA靶向位点上GFP局部积累的潜力。

 

图1 三聚化基序foldon触发foldon-GFP-PCP与sgRNA-PP7的组装

CRISPR FISHer通过组装foldon-GFP-PCP和工程sgRNA来提高靶向重复基因组位点的信噪比

为了探究foldon-GFP-PCP是否可以被招募到活细胞中的CRISPR靶点并积累，首先利用dCas9-mCherry和靶向Chr3q29的重复基因组区域（~500个重复，Chr3Rep）的sgRNA-2×PP7进行标记。随后，在人骨肉瘤U2OS细胞中，核转染表达foldon-GFP-PCP的质粒（图2a）。成像显示foldon-GFP-PCP病灶在核转染后4小时就出现，与Chr3Rep位点共定位，并逐渐变得更明亮、清晰，而dCas9-mCherry的荧光强度没有明显富集（图2b）。这说明靶DNA结合的dCas9/sgChr3Rep可能将foldon-GFP-PCP招募到靶向位点，同时增强靶位点的GFP信号，减少非特异性背景。为了排除先后依次递送的影响，作者还将包括foldon-GFP-PCP、dCas9-mCherry和sgChr3Rep-2×PP7在内的质粒共转染到U2OS细胞、HeLa、HepG2细胞中，进行进一步的共定位分析。与预期相同，转染后16小时，foldon-GFP-PCP与dCas9-mCherry共定位良好（图2c）。

接下来，对U2OS细胞中端粒进行标记，并将CRISPR FISHer（dCas9/sgRNA-2×PP7/foldon-GFP-PCP）与两种传统的CRISPR成像系统（dCas9-EGFP/sgRNA-2×PP7和dCas9/sgRNA-2×PP7/PCP-GFP）进行对比。靶向端粒位点的CRISPR FISHer显示出更高的灵敏度（图2d），信噪比高达246（图2e），说明CRISPR FISHer标记重复基因组位点效果明显优于传统的两种CRISPR成像系统。而作为阴性对照的sgGal4-2×PP7（在人类基因组中缺乏同源靶点）的CRISPR FISHer不能在核质中显示特定的病灶（图2d）。以上结果表明foldon-GFP-PCP和sgRNA-2×PP7能够在靶基因位点快速聚集，最大化靶点处的GFP信号，并最小化活细胞中的背景噪声（图2f）。

图2 Foldon-GFP-PCP能通过CRISPR FISHer增强信噪比实现稳健的重复基因组位点跟踪

通过单个sgRNA, CRISPR FISHer在活细胞中完成了内源性非重复基因组区和外源性HBV诊断的可视化

作者利用CRISPR FISHer对活细胞中非重复基因组区域的PPP1R2基因座（距离Chr3Rep约15 kb）进行成像。将质粒转染到dCas9-U2OS细胞中表达靶向PPP1R2基因的sgRNA（sgPPP1R2.1-2×PP7）和foldon-GFP-PCP（而对照组表达sgPPP1R2.1-2×PP7和PCP-GFP），观察到foldon-GFP-PCP有2-4个明亮的绿色荧光亮点，但在对照组PCP-GFP中没有观察到（图3a，b），这表明CRISPR FISHer有能力成像PPP1R2基因位点，并监测非整倍体U2OS细胞中的基因拷贝数。

为了验证CRISPR FISHer标记非重复DNA区域的特异性，作者使用CRISPR FISHer标记PPP1R2基因，并使用2×MS2或8×MS2 CRISPR系统作为内参标记Chr3Rep（图3c）。与预期相同，在300个GFP阳性U2OS细胞中，超过90% sgRNA-2×PP7或sgRNA-8×PP7 CRISPR FISHer靶向的位点与内参信号高度共定位，而sgRNA-1×PP7没有显示CRISPR靶点（图3d）。

为了验证CRISPR FISHer标记非重复DNA区域的灵敏度，将CRISPR FISHer与另一种成像系统CRISPR-Sirius对比（图3d-f），它能够检测低至22个重复序列基因位点。结果表明，带有sgRNA-2×PP7或sgRNA-8×PP7的CRISPR FISHer能够可视化活细胞中的PPP1R2基因位点，而带有sgRNA-8×PP7的CRISPR-Sirius和带有sgRNA-1×PP7的CRISPR FISHer则不能（图3d-f）。这表明CRISPR FISHer对于单拷贝基因成像是有效且灵敏的。由于sgRNA-2×PP7和sgRNA-8×PP7的信噪比没有显著性差异（图3f），后续实验主要使用sgRNA-2×PP7的CRISPR FISHer体系。

图3 CRISPR FISHer实现内源性非重复基因组区域的可视化

为了进一步测试CRISPR FISHer标记非重复区域的特异性，在同一细胞中用不同荧光分别标记PPP1R2、Chr3Rep和Chr13Rep位点（图4a）。与预期相同，CRISPR FISHer标记的PPP1R2基因位点与Chr3Rep共定位，但不与Chr13Rep共定位（图4b，c）。随后对U2OS细胞中Chr3Rep或Chr13Rep以及单拷贝基因的位点进行成像（图4d），无论是Chr17上的TOP3基因还是Chr20上的TOP1基因都不与Chr3Rep或Chr13Rep共定位（图4e，f）。最后，进行标准DNA FISH实验，使用Alexa Fluor 568染料标记Chr3Rep和Chr13Rep位点，证实CRISPR FISHer标记的PPP1R2和SOX1位点与FISH探针标记的重复位点共定位（图4g）。以上结果表明，CRISPR FISHer系统能够精确可视化单个活细胞内的非重复基因组区域。

此外，作者还将CRISPR FISHer测试扩展到Hep3B活细胞，以肉眼检测乙型肝炎病毒（HBV）。靶向HBV的sgRNA能够观察到亮灶，而对照组sgGal4没有，这与先前的报道的Hep3B细胞含有HBV整合物的结论一致（图4h）。

图4 CRISPR FISHer实现活体细胞中内源性非重复基因组区和外源性HBV诊断的可视化

 

CRISPR FISHer能够跟踪活细胞中DNA双链断裂（DSB）诱导的染色体分离和随后的染色体内和染色体间重新连接的连续过程

为了监测非同源末端连接（NHEJ）过程的动态，作者标记了单个活细胞中来自同一染色体的DSB的两端。首先利用CRISPR FISHer以sgPPP1R2.2/foldon-GFP-PCP标记PPP1R2基因，并利用CRISPR-Sirius以sgChr3Rep/stdMCP-tdTomato标记dCas9-U2OS细胞中的Chr3Rep基因。16 h后，对靶向PPP1R2基因的saCas9/sgRNA质粒进行核转染，以诱导转染细胞中Chr3上这两个标记基因位点之间的DSB（图5a）。与预期相同，在活性saCas9/sgRNA传递4小时后，捕捉到三对PPP1R2和Chr3Rep位点的裂变和融合，这证实了CRISPR介导的3号染色体靶位点的切割和随后的NHEJ介导修复（图5b）。

此外，在DSB之前，pair 1的位置与pair 2和3有一定距离，在切割后变得更近（图5b），这表明DNA损伤后，初始染色质构象发生了改变，增加了含有DSB的染色体域之间的空间接近性。观察PPP1R2基因的GFP标记和Chr3Rep基因的tdTomato标记的实时运动（图5c, d），发现它们至少保持了0.5 h的共定位，并逐渐分离至3.24 µm的距离，分离约0.5 h后最终结合在一起。pair 2和3也呈现的相似动态（图5e, f）。

为了可视化染色体易位的动态过程，使用图4a中相同的策略来标记PPP1R2基因（GFP）、Chr3Rep（tdTomato）和Chr13Rep（Halo），并利用靶向Chr3和Chr13的活性saCas9/sgRNA编辑系统诱导DSB。其中，一个断裂位点位于Chr3上的sgPPP1R2.2和sgChr3rep靶向位点之间，另一断裂位点位于SPACA7基因上，距离Chr13Rep约82 kb（图5g）。saCas9/sgRNA核转染后，观察染色体断裂和易位的过程。最初，Chr3上的sgPPP1R2.2和sgChr3rep靶向位点（GFP/tdTomato）重叠超过6 h，随后分离至7.59 µm。CRISPR FISHer标记的PPP1R2基因位点在Chr13上与sgChr13rep靶向位点共定位（GFP/Halo）（图5h，i），这可能表明DSB诱导的小染色体片段移动到很远的地方，导致染色体内修复失败，最终通过染色体间端连接进行修复。此外，还观察到细胞内的染色体间和染色体内的NHEJ修复（图5h），表明标记三个位点能够跟踪相同或不同染色体上多个可能的NHEJ过程，这表明DSB两端之间的距离可能决定了染色体间或染色体内修复的选择。

图5多个CRISPR靶位点的同步成像跟踪了活细胞中DNA DSB诱导的染色体分离以及随后的染色体内和染色体间再连接的实时动态

除了基因组DNA分子外，细胞还包含其他类型的DNA，例如染色体外环状DNA（eccDNA）。由于eccDNA体积小，用DAPI或DNA FISH对其可视化具有挑战性。作者将CRISPR FISHer用于研究活细胞中的eccDNA。首先从HepG2细胞中分离并测序eccDNA（图6a）。其中，eccBEND3、eccGABRR1和eccPRKCB的序列分别通过三轮PCR、TA克隆和Sanger测序进行了独立验证。eccDNA连接序列被选为CRISPR FISHer靶向位点，因为它们在人类基因组中不存在，CRISPR FISHer能够特异靶向（图6b）。作者观察了HepG2细胞中CRISPR FISHer靶向位点的空间分布（图6c），并计算了每个eccDNA的数量（图6d），表明了CRISPR FISHer在标记和跟踪eccDNA方面的可行性。

接下来跟踪单个的eccBEND3位点和Chr3上的sgPPP1R2.2靶向位点的时空动态（图6e;补充信息，视频S3-S5），发现eccBEND3位点的平均移动距离和空间在同一时间段内超过了Chr3（图6e，f），这表明eccDNA具有较长的轨迹和更快的运动速度。此外，利用PCR扩增了相同长度和序列的线性版的eccDNA，并使用CRISPR FISHer分析线性版的行为，并跟踪其细胞动力学（图6g, h）。结果发现原生圆形ecDNA比线性化的ecDNA移动更快。说明eccDNA的圆度对其快速运动至关重要（图6i）。这种独特的动态特征表明，eccDNA可能以一种循环依赖的方式作为一种移动信号转导分子，与之前报道的eccDNA作为先天免疫刺激物需要的是其圆形形态而不是线性或序列的结论一致。

最后将CRISPR FISHer的应用扩展到对入侵DNA实时成像。首先通过核转染将靶向rAAV基因组TBG的CRISPR FISHer传递到U2OS细胞中。在用AAV和sgTBG质粒处理后的细胞种观察到特异性的GFP聚集，而没有AAV感染或sgGal4质粒转染的情况下没有检测到（图6k，l），这表明CRISPR FISHer能够在活细胞中标记AAV基因。值得注意的是，在AAV感染后观察到ds AAV DNA的出现（图6l），这表明CRISPR FISHer有助于评估活细胞中AAV DNA分子的有效数量。同时，可视化了ds AAV DNA位点的时空动态，发现单个位点具有与eccDNA相当的高移动性，但在小空间内移动（图6m，n），表明AAV dsDNA处于一个封闭的区域，这可能有利于其转录。

全文总结：

本文报道了CRISPR FISHer的多功能系统，它可以完成来自内源性或外源性DNA的非重复DNA序列的活细胞成像。CRISPR FISHer利用基于三聚体蛋白基序和工程化sgRNA触发的相分离介导的信号放大策略，有效地提升了靶标位点的荧光信号，显著提高了信噪比，实现了活细胞中单个非重复序列的成像。CRISPR FISHer能够有效地监控DSB诱导的染色体分离和染色体内重新连接以及染色体间的易位过程。除了基因组DNA，还可以跟踪eccDNA的时空动态。

DOI：https://doi.org/10.1038/s41422-022-00712-z