NAT BIOTECH丨模块化细胞因子受体靶向嵌合体用于细胞膜蛋白和胞外蛋白的降解
今天给大家分享的文献是今年9月份发表在Nature Biotechnology上面的题为《Modular cytokine receptor-targeting chimeras for targeted degradation of cell surface and extracellular proteins》的一篇文章。本篇文章通讯作者是美国加州大学旧金山分校的Jim Wells教授，Jim Wells教授主要研究方向之一为蛋白质和小分子设计用以调节细胞信号传导。
作者介绍：
将细胞表面和细胞外蛋白递送至溶酶体进行降解是调节细胞外生物学的重要手段，然而，现有递送策略具有模块化和组织靶向性不足、无法同时适用于细胞表面和细胞外蛋白的缺陷。为解决这一问题，研究人员开发出一种新的蛋白质降解策略：细胞因子受体靶向嵌合体（KineTAC）。其本质是一种重组的双特异性抗体，作者把细胞因子和可以结合靶蛋白的抗体通过突变的Fc段重组到一起，形成双特异性抗体KineTAC，细胞因子可以和细胞表面受体结合，通过内化作用递送到溶酶体；因为抗体也会和细胞表面的靶蛋白结合，所以一起被拉到溶酶体中，从而实现了靶蛋白降解（图1a）。
结果与讨论：
1、 靶向降解细胞膜蛋白的KineTAC的构建与表征
图1：用于靶向降解治疗相关细胞表面蛋白的KineTAC平台。
作者关注到趋化因子CXCL12与诱饵受体CXCR7结合，这一过程会进一步导致β阻滞素募集，导致没有下游信号传导从而产生嵌合体内吞。基于这一原理，作者将趋化因子CXCL12的N端融合到双特异性抗体一端的Fc结构域中，而另一端则融合可与靶蛋白结合的抗体，并通过Knob-in-Hole的蛋白设计策略在单个哺乳动物结构中表达双臂，完成双特异性抗体KineTAC的组装。
首先，研究人员通过流式细胞术验证了CXCL12的同型对照可以与表达CXCR7的MDA-MB-231细胞有结合（图1c）。后用可以靶向PD-L1的单抗 atezolizumab的Fab片段与CXCL12重组成了靶向PD-L1的KineTAC，用生物膜干涉技术（BLI）验证了KineTAC与PD-L1有非常好的亲和力（图1b）。接着，作者在MDA-MB-231细胞层面上验证了KineTAC CXCL12-Atz可介导PD-L1降解，单独或物理混合无此作用（图1d、e、f）。作者进一步在PD-L1/HER2/EGFR等癌细胞中常见的膜蛋白上测试了KineTAC的性质，并且证明了KineTAC可以推广到8种治疗相关的细胞膜蛋白和胞外蛋白。
2、 对KineTAC介导蛋白降解的影响因素研究
图2：对KineTAC介导蛋白降解的影响因素研究。
接下来评估靶蛋白降解的影响因素。作者主要从受体信号传导、亲和力、pH、结合表位4个角度出发。
- 受体信号传导
CXCL12不仅可以和细胞表面的CXCR7结合，还与信号受体CXCR4有结合。CXCR4可以引起下游信号转导（如：促进肿瘤转移等），所以作者设计突变产生了CXCL12的3种变体（∆KP，∆KPVS和R8E），让其不引起CXCR4下游信号的转导，看是否对降解有影响（图2a）。
结果：发现突变后不影响对靶蛋白PD-L1的降解，即通过CXCR4传输的CXCL12信号不是降解的关键。
- 亲和力
突变与PD-L1结合端的抗体，改变对PD-L1的亲和力，产生了一系列亲和力不同的变体，考察这些变体构成的KineTAC对PD-L1降解的影响。从Kd值和PD-L1的含量水平来看，Kd值越小，降解能力越好，亲和力的差异对降解的影响较大（图2c、d、e、f）。
- pH
确定pH依赖的抗体组成的双特异性抗体是否会因为pH的改变对降解产生影响。将一种PD-L1抗体BMS936559（已知其在pH<6的酸性条件下会释放PD-L1），重组成CXCL12-BMS936559，与CXCL12-Atz相比，CXCL12-BMS936559的最大降解效率只是略有降低，所以这种kineTAC的方法是基本不受ph影响的（图2g）。
- 结合表位
针对EGFR，测试了5种单抗组成的KineTAC对EGFR的降解，发现不是所有抗体组成的KineTAC都有效果，没效果的KineTAC，组成它的单抗的抗原表位，距离细胞表面远。基于以上这些数据，表明了KineTAC介导的降解依赖于与抗原的结合表位（图2i，Extended Data Fig. 4d）。
Extended Data Fig. 4d：EGFR细胞外结构域示意图
3、 KineTAC可高效介导靶蛋白降解
图3：KineTAC以高特异性、溶酶体和cxcr7依赖性的方式介导靶蛋白降解。
作者研究KineTAC对靶蛋白降解的机制。用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂bafilomycin预处理细胞，发现bafilomycin预处理过的细胞有降解恢复，表明KineTAC依赖溶酶体途径降解（图3a）。免疫荧光显微镜显示，与PBS对照相比，CXCL12-ctx处理24小时后，细胞表面的EGFR几乎完全消失，进一步强调了KineTAC可显著诱导靶蛋白的内化（图3b）。作者进一步通过siRNA敲低CXCR4的表达水平，排除CXCR4信号通路的作用后，仍有明显的降解效果，确定了细胞表面介导蛋白降解的主要受体为CXCR7（图3f）。接着，作者通过定量质谱法确定KineTAC治疗后蛋白质组的变化，与表面富集的样品对照处理相比，PD-L1实际上是CXCL12-Atz处理后唯一下调的蛋白（图3h）；与PBS对照细胞相比，靶向EGFR的KineTAC CXCL12-Ctx处理的HeLa细胞也观察到类似的结果（图3j，k）；全细胞蛋白质组学也显示没有发生重大变化，表明KineTAC治疗方法良好的特异性。用改良的MTT法研究KineTAC及其对应的单抗杀伤细胞的能力，发现KineTAC可以明显诱导细胞凋亡，体现了KineTAC的功能优势，因为传统单克隆抗体只是抑制，而没有降解（图3l）。给小鼠注射KineTAC后，KineTAC保留了10天，半衰期在7天左右（图3m），不会被迅速清除，表示其药代动力学参数良好。
4、 KineTAC可介导胞外蛋白降解
图4：KineTAC使细胞吸收可溶性细胞外蛋白。
在介导胞外蛋白方面，研究KineTAC是否可以促进VEGF（血管内皮生长因子）或TNF-α（肿瘤坏死因子）的细胞吸收（图4a）。重组靶向VEGF的KineTAC，CXCL12-beva，流式细胞仪分析显示，当VEGF - 647与CXCL12-Beva共孵育时，细胞荧光增强了32倍，而与Beva同型IgG共孵育时则没有（图4b，c）。Bafilomycin预处理也降低了CXCL12-Beva吸收细胞外VEGF-647的能力（图4e）。以上这些数据表明KineTAC成功地介导了胞内对胞外VEGF的吸收和向溶酶体的传递。KineTAC介导的VEGF摄取是有时间依赖性的，类似于膜蛋白降解，在6小时开始有较强吸收，在24小时达到稳定状态（图4f）。接下来，作者测试了CXCL12-Beva促进其他细胞系（包括乳腺癌和肺癌细胞系）吸收的能力，发现这些细胞也显著吸收了VEGF（图4h）。这些数据表明，KineTAC可以促进细胞外可溶性配体的吸收，表达更高水平CXCR7的细胞系导致更多的吸收。
总结：
综上，本篇文章中，作者构建了一种将细胞表面蛋白和细胞外蛋白递送至溶酶体降解的新方法，称为细胞因子受体靶向嵌合体（KineTAC）。研究发现，结合亲和力、表位、构建体设计和降解受体与靶蛋白的比例等因素可显著影响KineTAC介导的蛋白质降解效率；而靶蛋白的信号传导能力和pH值，对降解效率没有明显影响。这些结果为如何设计、优化和扩展有效的KineTAC提供了宝贵的依据。
