CELL丨具有可定位相分离RNA的大肠杆菌空间工程

大家好，今天分享的文献是2022年9月发表在cell上的“具有可定位相分离RNA的大肠杆菌空间工程”。

有关作者：

本文作者是巴黎大学交叉学科创新研究院的Ariel B. Lindner教授，主要通过物理，化学和系统/合成生物学方法来研究衰老的关键问题。

该课题组在2011年在Science 上发表了“Organization of Intracellular Reactions with Rationally Designed RNA Assemblies”，利用RNA的自组装在大肠杆菌体内形成线状即二维的结构，并通过结构单元设计招募蛋白，以自组装结构作为“支架”，在体内构建功化模块。

研究背景：

• 生物大分子凝聚物组织细胞的生物化学过程 

真核细胞的细胞核，细胞质和膜中的含有大量通过生物大分子相互作用形成的凝聚物，目前研究认为，多价弱相互作用驱动相分离现象的形成，组成成分控制原理被描述为一个简单的模型：多价支架和与之配对的低价配体组成，在比例不同或者配体价态不同时，形成不同的凝聚物。

而在这样的相分离形成的无膜细胞器中，不同相内的分子浓度不同将极大地影响反应动力学，在蛋白质内在无序区，多价支架相互作用以及RNA组成的凝结物种，物理性质和化学性质都将影响其状态，并发挥不同的生物学功效。

整体设计：

在本篇文章中，作者构建了转录工程可定位的RNA 液滴 (TEARS) 作为合成 LLPS 的基于 RNA 的模块化系统。其中重复的RNA序列驱动LLPS的形成，作为相分离的“溶剂”，而RNA 序列末端串联的用于招募“溶质”的domain可以通过不同的功能序列与目标分子结合，从而实现特定功能。TEARS 的模块化设计能够独立地设计和优化代谢途径成分的表达和定位。作者证明在没有任何其他哺乳动物细胞核元件的情况下，rCAG 重复序列足以在细菌中形成LLPS。

结果与讨论：

1. CAG重复序列形成具有选择性渗透性的RNA缩合物：

47个rCAG 重复序列，连接12个MS2 aptamer(rCAG-MS2)在哺乳动物细胞中能够形成液相凝聚物。作者通过TEM和相差显微镜证明，在大肠杆菌中也能够形成致密的液滴。而更换招募蛋白的适体同样有相似的现象，适体与招募的“溶质”具有一一对应的性质。RNA驱动的LLPS是独立过程，与被招募的蛋白无关。rCAG 重复作为 LLPS 的足够域和模块化控制元件，允许正交串联适体或翻译单元在没有额外特定连接分子的情况下被传递到 TEARS。不会非特异将其他蛋白裹入，并且此驱动过程符合前期研究的认知（无细胞体系不能发生）。

2. 细菌细胞内 TEARS 的液体状特性

接下来，作者从液体的物理特性与液体的动态变化两个方面对TEARS性质进行测定。与细胞质膜接触的液滴通常呈现出凹形半月板，作为液体，TEARS 的形状受表面张力和相邻物体的特性控制，最有可能驱使它们形成球形液滴，以最小化表面积或适应细胞质膜的形状。TEARS 在细胞极、分裂平面以及多核细胞内的类核之间的定位让人想起受类核控制的被动缓慢扩散的细胞内实体的定位。作者通过共表达致病的有极化位置取向蛋白，证明液滴以液体形式嵌入。

在动态观测方面，作者通过微流控手段记录了荧光衰减与细菌成长曲线一致，能够发生类似液滴融合的现象，以及在抗生素处理下，细胞破碎时由于张力变化液体由半球形变成球形的过程，证明了其液体性质。

3. 单一“溶质”的富集形成了多相结构

作者采用了较为经典的相分离模型，利用 ABD 标记的荧光蛋白报告分子作为溶质，研究溶质在胞质溶胶和 TEARS 之间的募集和分配动力学。当 rCAG 适体融合过表达时，同时观测到了GFP含量多和含量少的RNA液滴（在TEM下验证），并观测到了碰撞和融合现象，并且在较大的液滴中观察到了多层的荧光，可能是只有与胞质外层招募到GFP造成的（拴在膜上的双层液滴仅在细胞溶质界面而不在膜界面显示荧光，与液滴的深度和密度无关）。构建出更加简单的多层相分离体系，并且与蛋白支架的以往认知不同，高价的RNA平台有富集作用。

4. 通过非平衡机制调节组合物和双分子结合效率

作者通过TEARS 直接募集主要溶质分子受体，而受体又募集次要溶质配体构建了一个动力学模型，使用双分子荧光互补(BiFC) 分析和缓慢成熟的分裂 GFP系统作为报告信号。配体的选择性分类受生长介导的溶质稀释和受体-配体结合的相对速率控制，相对较慢的是BiFC 速率。在大肠杆菌的指数生长期，RNA液滴形成的速率较快使得荧光互补被隔绝，因此低于对照，在平台期逐渐积累，荧光更强。

总之，TEARS 类似于使用非平衡动力学控制和组成反应的天然多组分细胞器。这种配体分类的非平衡调整仅通过一对相互作用的分子来实现：携带相同受体 (FA) 的 TEARS 可以在不同的生长条件下显示不同的配体 (FB) 结合方案。这与称为“脚手架-客户”模型的平衡机制形成对比，其中招募偏好由具有不同结合位点的多个支架的化学计量控制。

5. 相分离提供了控制反应稳定性的多种机制

使用附设受体-配体结合模型反应使用 TEARS 来调节溶质（例如 ABD-GFP）浓度的波动。许多细胞内反应都会反应物的含量不是高敏感度的，这有利于生物体缓冲环境变化和内在干扰，对冲外部的危险变化。

TRAES可以增加细胞间异质性，大肠杆菌在细胞分裂时的方向性导致子细胞之间的胞质的不对称分配，最终使得TEARS产生丰度的表型变异，产生了类似靶向细胞质中“溶质”的现象。提高了 ABD-GFP 荧光的变异系数 (CV)。而这种“噪音”可以使用双分子荧光系统来控制，噪声缓冲效应随生长方式而变化。在指数增长期间，不对称分裂增加噪声的，但由于 TEARS 的 FA-tdMCP 支架，变异性总体降低了 21%；在静止期，FB 被招募到不同大小和承载能力的 TEARS 中，导致2到3倍放大的变异性。

总之，TEARS 可能起到缓冲或强调在不同环境中出现的细胞间变异性的表型效应的作用。合成 TEARS 的相对简单性使其成为理解生物噪声控制的合适模型。

6. 生物应用举例

通过来自紫色色杆菌的 Vio 操纵生物合成紫色抗肿瘤脱氧紫色素 (DV)色素的过程中，VioABEC 的连续催化通过支化中间体原脱氧紫胶酸 (PVA) 将 L-色氨酸转化为 DV。PVA 可能会自发形成红色脱氧紫胶素原 (PDV)，然后进一步二聚化成绿色脱氧铬绿素 (DCV) 只有存在足够的 VioC 催化该反应时通过竞争反应转化为紫色 DV。

作者通过用 tdMCP 标记所有四种酶来改变这一代谢过程。在没有聚ABEC的情况下，所有酶融合的过表达主要将代谢通量导向PDV-DCV 的产生，聚集所有四种 VioABCE 途径酶，细胞仅产生DV。

总结：

1.作者构建了一种模块化方法来利用由基于 RNA 的缩合物制成的功能性合成无膜细胞器，以从根本上理解 LLPS 和代谢工程。该系统可以通过合并额外的 rCAG 适体或通过招募寡聚蛋白作为更详细表征或启用新基因来进一步扩展。

2.使用 TEARS 作为大肠杆菌中 LLPS 的模型，观察到以前在体外或单蛋白 LLPS 系统中没有表征的行为，包括多相分离、成分控制和噪声调节的机制。作者证明的受生长阶段控制的 TEARS 反应性。除了它们在降噪中的既定作用之外，还证明了冷凝物可能对表型变异性产生不同的影响，在空间上控制细胞内反应。

3. 作者使用与 MS2 或 BoxB 适配体的多个重复融合的 rCAG 重复，其重复数与 LLPS 形成和溶质募集之间的关系尚未确定，并且该设计与适配体的选用息息相关，对于形成液滴的内部理化环境仍然需要进一步的研究。