ADV MATER丨酶介导的细胞内AIEgens用于点亮肿瘤定位和治疗

大家好，今天和大家分享的是5月份发表在Advanced Materials 上的文章，题目为Enzyme-Mediated Intracellular Polymerization of AIEgens for Light-Up Tumor Localization and Theragnostic。文章的通讯作者来自新加坡国立大学刘斌教授，刘斌教授长期研究有机纳米功能材料，高分子化学及有机材料在生物医药研究的应用。

2001年，唐本忠院士团队在研究1-甲基-1, 2, 3, 4, 5-五苯基噻咯的发光行为时发现，溶解在乙腈中的这一分子不发光，但随着大量不良溶剂(水)的加入，混合体系的发光变得很强。由于该分子呈现疏水性，水的加入势必引起分子的聚集，所以该分子发光的显著增强与聚集体形成密切相关。并提出AIE的原理是：单个分子因为会发生单链的转动导致能量以非辐射的方式释放，因此单分子不会发光，当分子聚集则会限制单个分子的运动，从而更多能量的释放会以辐射方式发出，产生可见的荧光。这种机制也称为分子运动受阻机制。

但是2020年6月份的一篇文章名为Direct Observation of Aggregation-Induced Emission Mechanism对这AIE的机制做出了更直观的阐明。文章指出这种分子运动受限机制听起来很符合直觉的猜想，但并不受基本物理化学原理支持。文章利用超快多维紫外/红外混频光谱技术直接观察TPE分子，实时观测到在电子激发后的几皮秒内大部分四苯乙烯分子在稀溶液里迅速异构，产生环状中间体；而在固体里没有产生任何反应。这个环状中间体是TPE分子电子激发态经过一个特殊构像的直接证据。

本文的主要思路是：设计一对分子 D2P1和3CBT，它们可以通过缩合反应进行原位聚合形成聚集体，用于肿瘤成像和治疗。D2P1由两个部分组成，即含有侧链保护半胱氨酸的酶可裂解的多肽，作为应答部分，可被谷胱甘肽(GSH)还原并同时被组织蛋白B裂解，以及在分子状态几乎无荧光但在聚集情况可以显示强荧光信号的AIEgen。

D2P1和3CBT进入肿瘤细胞后，被溶酶体中过表达的组织蛋白酶B切割，引发GSH诱导的1，2-氨基硫醇和3CBT中的CBT基团之间的生物相容性点击缩合反应。这可以导致D2P2和3CBT在肿瘤细胞内聚合，并在原位自组装成具有增强荧光信号的纳米聚集体。

此外，纳米聚集体的形成可能导致肌动蛋白组织的破坏，从而影响肿瘤细胞的迁移和生存。聚合体诱导的纳米结构在肿瘤中的滞留时间延长，可以直接导致PDT治疗效果的增强，因此这是一种有望用于长期肿瘤成像和抗肿瘤治疗的纳米药物。

作者首先测试D2P1在水溶液中的吸收光谱和发射光谱。如图A所示，D2P1的最大吸收峰在280而最大发射频率在600。图B是测试D2P1在体外的切割能力，采用的是D2P1与组织蛋白B和GSH共孵育，如高效液相色谱图所显示D2P1在没有组织蛋白B和GSH的情况下是不会分解，而与组织蛋白B和GSH共孵育的情况下有新峰形成，有新物质产生，间接证明D2P1能在组织蛋白B和GSH的情况下，脱去保护帽。图C是D2P1在组织蛋白酶B和GSH存在下与3CBT在反应缓冲液中孵育不同时间后的光致发光光谱。可以发现随着孵育时间的增加，荧光信号在不断的增强。而图D是D2P1在组织蛋白酶B和GSH存在下与3CBT孵育时的扫描电子显微镜图像。这两者证明了D2P1与3CBT体系能在体外进行。随后作者评估这对分子的细胞摄取效率，采用的是D2P1和3CBT对MDA-MB-231细胞共孵育，结果如图所示这对分子大概在4小时左右达到最大摄取量。随后作者好奇分子是否使用细胞内其他物质是否会影响到这对分子的这场工作，使用MDA-MB-231细胞裂解物与这对分子共孵育并进行高效液相色谱图分析，图E是结果图，可以发现其他物质对于D2P1的正常工作几乎是没有影响的。

在研究了 D2P1 可以在癌细胞内被还原和切割后，作者继续评估 D2P2 和 3CBT 是否可以在癌细胞内聚合。为了监测细胞内聚合，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）监测癌细胞与 D2P1 和 3CBT 共孵育后的时间依赖性荧光信号。如 CLSM 图像所示，与 D2P1 和 3CBT 共孵育 2 小时后，在细胞中观察到少量具有弱荧光的红点。随着孵育时间的增加，红点的数量和荧光强度都显着增加。

相比之下，仅与 D2P1 或 3CBT 孵育后，细胞仍然是黑暗的。此外，作者还在组织蛋白酶 B 缺陷型 NIH/3T3 细胞中研究了细胞内聚合。与 MDA-MB-231 细胞相比，NIH/3T3 细胞与 D2P1 和 3CBT 共孵育后未观察到明显的荧光。因此，特定的发光荧光是由于组织蛋白酶 B 介导的 D2P2 和 3CBT 之间的细胞内聚合。

为了研究细胞内聚合在改变细胞迁移中所起的作用，进行了伤口愈合迁移试验。未经任何处理或经D2P和3CBT处理的MDA-MB-231细胞在划伤后48小时表现出明显的迁移愈合能力，伤口闭合率高（75%）。但与 D2P1 和 3CBT 共同孵育 48 h 后，伤口愈合率下降至 30%，远低于对照组，表明与其他三组相比，运动性明显降低。

因此作者推测细胞的低运动性可能归因于细胞内聚合引起的纳米聚集体形成，这会影响肌动蛋白的完整性。为了更好地了解细胞内聚合如何改变肌动蛋白的完整性，作者用 Actin-555 对 F-肌动蛋白进行染色，以揭示用 D2P1 和 3CBT 治疗前后的形状变化。染色结果显示，D2P1 和 3CBT 的处理破坏了肌动蛋白的排列，而对照 MDA-MB-231 细胞显示出分布良好的肌动蛋白丝。D2P1和3CBT处理后肌动蛋白形态的显着变化表明D2P2和3CBT之间的聚合导致肌动蛋白动力学的破坏并导致细胞运动性降低。

通过上述实验，这促使作者研究 D2P2 和 3CBT 对细胞的毒性。在与不同浓度的 D2P1 和 3CBT 孵育后，对 MDA-MB-231 和 HT29 细胞进行了体外细胞毒性测定。在 5 至 100 µm 浓度范围内，在 D2P1 处理或 3CBT 处理的细胞中观察到对癌细胞增殖的抑制可忽略不计。然而，如果将上述两种细胞系与 D2P1 和 3CBT共同孵育，然后进行表征则当探针浓度高于60μm时可以观察到细胞死亡。

因此，作者接下来评估了在小鼠异种移植肿瘤模型中静脉注射后，这两种分子是否可以在所需的肿瘤部位被激活和聚合。在经瘤内注射 3CBT 或 PBS 预处理的带有皮下 MDA-MB-231 肿瘤的雌性裸鼠中评估了在肿瘤部位触发聚合的能力。通过静脉注射将D2P1给予荷瘤小鼠，并对这些小鼠进行荧光信号采集。注射后以不同的时间间隔记录荧光，在探针注射后的前 2 小时内，3CBT 预处理的肿瘤部位 D2P1 的荧光增强，在 24 小时的监测时间过程中缓慢下降。然而，仅对携带 PBS 预处理肿瘤的小鼠施用 D2P1 在肿瘤部位没有产生任何明显的荧光信号，注射后也显示出快速的荧光信号衰减。这些结果表明，D2P1 可以在肿瘤部位被激活并与 3CBT 聚合，导致在肿瘤中的特异性保留。通过测量器官和肿瘤中 D2P1 的浓度来表征 D2P1 和 3CBT 的体内生物分布。

最后，作者研究了 D2P1 在活体小鼠肿瘤治疗中的肿瘤抑制性能。将携带皮下MDA-MB-231肿瘤的小鼠分为四组。作为对照组，第1组小鼠仅用PBS处理，第2组小鼠注射D2P1，随后光照射，肿瘤接受D2P1和3CBT不光照射被指定为组 3。最后一组由用 D2P1 和 3CBT 处理的小鼠组成，随后在相同条件下进行光照射。发现在D2P1、3CBT和光照三者同时处在的情况下对小鼠肿瘤的治疗效果最好。

总结：作者设计开发了一对分子 D2P1和3CBT，它们可以通过缩合反应进行原位聚合形成聚集体，用于肿瘤成像和治疗。