NAT COMMUN | 用于更高带宽 DNA 计算的纳米孔接口

大家好，今天分享一篇2022年8月发表在Nature Communications上的一篇题为《A nanopore interface for higher bandwidth DNA computing》文章。该文的通讯作者是来自华盛顿大学计算机科学与工程系的Jeff Nivala教授，他的研究方向聚焦于纳米孔测序、单分子蛋白测序等。

本研究报道了一种基于纳米孔传感器的用于多种DNA电路输出信号的检测平台。该信号检测平台采用了一种生物素修饰的DNA链结构，当输出链与链霉亲和素结合后，置换出来的输出ssDNA将只能从3’端通过纳米孔，产生的纳米孔电流信号依赖于固定在孔内的链的序列信息。当输出ssDNA链被捕获进入纳米孔时，电流会显著下降，且输出被纳米孔捕获的时间具有高度的浓度依赖性。以此基础构建的标准曲线可以实现对输出链的浓度分析。

接下来作者验证了该方法能否测试DNA链置换电路的动力学特性，作者以seesaw链置换电路反应为例，在DNA门的输出链的反应序列和生物素之间修饰了一段polyT linker。将该DNA门加入MinION反应池中，加入输入链或空白对照后开始实时监测反应动力学。结果表明，纳米孔检测方法与使用荧光报告分子的方法所测定的反应动力学基本一致，而且由于该方法直接检测输出链，避免了使用荧光报告分子的方法所带来的非特异性链置换反应，这表明纳米孔方法可以用于灵敏特异地监测DSD反应的反应动力学。

接着作者通过在输出链上引入DNA条形码实现多重信号输出的检测。作者首先通过对输出链条形码区域引入单碱基突变来确定输出链的纳米孔可寻址区域，结果表明该区域中约6个核苷酸长度的子区域的突变会引起显著的平均离子电流信号变化，这段敏感序列区域即为输出链的纳米孔可寻址条形码。为了实现对不同条形码的准确分类，作者使用了卷积神经网络的算法提取原始纳米孔信号数据并实现自动条形码分类。作者还使用了两个条形码实验对两个电流的输出链进行同时实时监测，结果表明，只有加入了特异性输入链的电路条形码能检测到显著的信号，表明该分类器能够在样本中有未激活条形码的背景下正确识别激活的DNA电路。

作者接下来通过合理设计条形码集以进一步开发该方法的多重检测能力。作者使用ResNet-18 CNN算法在36个条形码的测试集的分类准确率仅为67%，从这个集合中，作者挑选了10个具有最高可分离信号水平的条形码，在该子集上的训练和测试可达到~96-97%的平均单分子分类准确率。作者接着使用这10个条形码对多种seesaw链置换电路进行输出信号检测，结果表明，所有其他条形码相比，每个样品中被激活的电路显示出更高的捕获频率，在包含五个seesaw链置换电路的样本中，可同时激活其中三个电路，这些结果证明了该纳米孔报告策略对多重DSD电路信号读取的能力。

最后作者尝试用该纳米孔报告系统应用于miRNA(let-7)的多种变异体的鉴别中。作者分别对三个变体:let-7a, let-7e，let-7c设计了三种探针，并对这三种探针的输出链上加入了三种不同的条形码。如果样品中存在特定的miRNA变体，它对应的探针会被触发，该探针的条形码输出链信号会被纳米孔传感器阵列检测到。实的结果显示，加入对应RNA输入后所对应的的探针条形码显著富集，表明该报告系统可以成功用于多重基于microRNA的诊断。

总结:作者开发了一种利用纳米孔传感器的DSD反应报告策略，与基于荧光的方法相比，该方法使用廉价的便携式设备对多个电路同时检测，具有更高的多重性和实时读取能力。此外，该方法了基于DNA序列的条形码，因此只需单一类型的DNA修饰(生物素化)，合成更简单，不容易受光漂白影响。然而，该方法同时也存在灵敏度和时间分辨率低，不能同时检测多个样品等缺点。