CANCER CELL丨利用血小板RNA实现肿瘤早筛和晚期转移的定位
今天分享的文献是这个月发表在 Cancer Cell上的利用血小板RNA实现肿瘤早筛和晚期转移的定位《Detection and localization of early- and late-stage cancers using platelet RNA》。
通讯作者是来自阿姆斯特丹大学医学中心的Thomas Wurdinger教授，他的主要研究方向是利用血小板RNA进行肿瘤诊断和伴随诊断，他们组分别在15年、17年、22年都在Cancer Cell发表了这一方向相关的文章。
血小板的正常激活对止血具有明显的重要性，而血小板的不当激活也可促进各种病理状态，包括血栓形成、炎症、糖尿病和癌症。而TEPs概念是来自于tumor educated cell，是指一些细胞在肿瘤细胞或肿瘤微环境的影响下功能的改变，最常用于来指巨噬细胞，其在肿瘤的影响下其通过释放各种生长因子、细胞因子和蛋白酶支持血管生成、侵袭和转移扩散。类比下可以得到TEPS（tumor educated platelets），在肿瘤细胞或肿瘤微环境的影响下功能的改变的血小板。因为血小板中没有细胞核，其功能的改变主要体现在RNA谱（或者蛋白谱）的改变。
循环肿瘤衍生DNA或RNA或者肿瘤转移细胞等液体活检生活标志物，需要复杂和专门的分离方法，还面临着低丰度难以检测等问题。相比之下，血小板是循环中仅次于红细胞的最丰富的细胞，几十年来一直使用简单、经济有效的方法进行常规分离。如果能利用TEPs检测肿瘤，将是很有潜力的生物标志物。
循环血小板具有约5500种不同spliced RNA，是一套很有价值又很复杂的生物标记物，研究人员试图通过智能选择软件对其中最相关和最有差异的spliced RNA进行选择。生物标记物panel选择过程中使用的样本越多，panel就越精确，但所需的计算能力和时间也就越多。通过迭代建模，使用来自244名无症状对照组和532名癌症患者的TEP RNA数据迭代测定生物标记物面板饱和度。确定了20个样本用于泛癌算法训练和另外20个样本进行算法优化。研究人员一共收集了来自欧洲和北美18种不同肿瘤类型、无症状对照（AC）或有症状对照（SC）的共2400多个不同年龄段（18-92岁）和性别的个体的血小板样本。无症状对照组包括来自普通人群所有年龄段的男性和女性，即没有癌症或其他严重疾病的病史或症状（390例）。症状对照组为特定症状性疾病，包括心血管疾病、良性肿块或炎症状态，但未诊断为癌症（333例）。抽血后48小时内，使用标准差速离心方案分离血小板样本，质控显示有核细胞污染低，血小板活化低。在血小板RNA测序后的结果进行严格的质量控制后，纳入2351个样本进行分析（~3%的退出率）。比较发现不同样本供应机构之间无症状对照组的血小板RNA组成略有不同，这可能是由于样本处理方式不同，残留血细胞和/或血浆cfDNA污染所致。为了尽量减少这种影响，采用了数据校正步骤。
研究人员首先通过血小板RNA建立泛癌检测方法。泛癌检测算法的开发和验证使用年龄配对人群进行，包括18种肿瘤类型中的16种（训练集n=270；评估集n=262）和无症状对照组（训练集n=121；评估集n=123）。与真实环境相比，症状对照组的患病率高于无症状对照组，因此没有纳入培训和评估。每一种肿瘤的训练集和评估集共有大约40个样本。最后得到了493个RNA的泛癌诊断生物标记物panel（训练集：曲线下面积（AUC）0.91，n=391；评价集：AUC 0.87，n=385）。这493个RNA生物标记物与之前在其他血小板RNA研究中发现的各种癌症患者的结果之间存在重叠。随后，泛癌检测算法经验证集进行独立验证，无症状对照组的特异性为99%（n=146），总体敏感性为64%（n=1096），四个肿瘤阶段的检测准确率为46%-72%（一期46%[n=65]，二期47%[n=112]，三期54%[n=275]，四期72%[n=617]，未知阶段61%[n=127]）。与早期癌症相比，晚期癌症的检出率更高。在测试患有各种非癌症疾病（如心血管疾病、良性肿块或炎症状态的个体）的血小板RNA谱时，泛癌检测算法的特异性降低至78%（n=333），表明泛癌检测算法可能会导致非癌疾病患者的假阳性检测结果增加，或者在训练过程中包括症状控制后检测精度降低。
接下来，研究人员确定TEPs RNA谱中的肿瘤类型特异性谱，来确定肿瘤起源部位。构造一个多分类组判别算法，为了保持每组样本的合理数量(至少100个样本)，肿瘤类型仅包括非小细胞肺癌(n = 522)、卵巢癌(n = 144)、胶质瘤(n = 132)、胰腺癌(n = 126)和头颈癌(n = 101)
为了提高算法的训练能力，采用了5倍交叉验证的方法，将80%的样本分配到一个训练集中，其余20%的样本用于验证集。得到了共93个RNA的肿瘤部位特异性的生物标志物RNA panel，通过算法的两次预测，总体准确性可以达到85%。
最后研究人员探索了脑转移肿瘤患者的血小板RNA是否与无脑转移肿瘤患者的血小板RNA是否存在差异。对132例（脑部原发的）胶质瘤患者、93例脑转移患者和299例无脑转移的肿瘤患者进行了分析。得到1322个差异的RNA。源于大脑的和源于颅外的癌症样本之间存在差异，但脑转移样本聚集在两者之间，说明至少对于脑转移瘤，血小板RNA谱是受到原发肿瘤和转移瘤两方面的影响的。
总结来说，血小板很容易纯化，数量无限多，在通过血管系统时死亡的可能性也小得多，那么TEP取代CTC成为最有前景的肿瘤液体活检吗？在给出肯定的答案之前，还有很多问题需要解决：这种检测方法的稳健性如何？是否有可能将panel简化到在日常工作中可行的程度，仅检测更小的panel而保持可接受的准确性？血小板RNA会因年龄或各种非恶性疾病的存在而变化多少？癌症患者研究的敏感性阈值是多少？单个肿瘤细胞不太可能“educate”大量血小板。那么，在可以检测到明显的变化时，需要多少癌细胞？肿瘤细胞的多克隆性对此会有什么影响呢？如何利用转移患者的血小板可受到原发肿瘤和转移肿瘤部位影响来实现肿瘤转移的检测？
