NAT BIOMED ENG丨通过分子信标中的酶促荧光放大对炎症相关mRNA进行空间分辨的体内成像

大家好，今天分享的文献是2022年9月发表在nature biomedical engineering上的一篇文章《Spatially resolved in vivo imaging of inflammation-associated mRNA via enzymatic fluorescence amplification in a molecular beacon》，通讯作者是来自国家纳米中心的李乐乐教授。李乐乐教授的研究领域为纳米探针构建及其在癌症等重大疾病的诊断与治疗领域的基础应用研究，重点通过功能性DNA分子设计，以及在纳米材料表界面组装，构建新型纳米生物探针，并应用于疾病的精准诊断与治疗。

研究背景

炎症（Inflammation）被认为是包括缺血性中风、扩张型心肌病和癌症在内的多种疾病发病的关键因素。因此，对炎症过程的准确监测在早期诊断和疾病干预中具有重要价值。
常规诊断方法包括血液生物标志物测试、组织活检和尿液分析，但这些通常只是单时间点测试，无法用于炎症过程的实时、动态监测。而分子成像（Molecular imaging）因为具有非侵入性、实时等优点，为监测炎症的发生和发展提供了极具潜力的方法。
最近的一些研究显示，RNA可通过改变表达和定位来调控炎症发生、发展和消退，是炎症过程中的关键调控因子，因此，RNA 可能作为炎症诊断的生物标志物，但是将 RNA 作为生物标志物用于炎症的体内光学成像尚未得到证实。

在过去二十年里，科学家们开发出了一系列能够灵敏检测 RNA 的技术，包括荧光原位杂交（FISH）、原位测序等方法，可提供单细胞甚至亚细胞分辨率的 RNA 检测。然而，在进行RNA成像时需要放大RNA信号，但这些方法通常需要提前固定和通透细胞。此外，这些信号放大方法往往还缺少空间分辨率和细胞选择性，这些都限制了其在体内成像的实际应用。

分子信标（Molecular Beacon，MB）为 RNA 分析提供了一种直接且广泛适用的工具，MB 辅助信号放大可以提高 RNA 检测灵敏度，但它仅适用于在试管中的检测，尚未应用于活体动物的 RNA 成像。

设计理念

作者团队设计了一种人嘌呤/嘧啶缺失核酸内切酶1（APE1）触发的分子信标（MB）探针（E-MBP），用于体内RNA的特异性放大成像，从而能够直接评估炎症。APE1是一种多功能酶，通过去除无嘌呤/嘧啶（AP）位点来修复DNA损伤。其信号放大机制在于 MB的RNA靶向性与针对炎性细胞选择性切割。E-MBP是通过将两个AP位点合并到MB的发夹环中，同时其茎末端用荧光团和猝灭剂标记，由于Förster共振能量转移，导致低荧光背景。当一个E-MBP与一个靶RNA杂交时，APE1形成两个识别位点以切割信标链，同时释放靶RNA以进行下一个周期。在多次循环后，一个靶RNA可以诱导许多E-MBP的切割，实现信号放大。此外，由于APE1可从炎性细胞的细胞核转移到细胞质，E-MBP在炎性细胞中的荧光信号比正常细胞中的信号更加明显，从而显著提高成像灵敏度和细胞特异性。           

研究结果

与常规MB一样，设计用于与靶杂交的E-MBP环长24个碱基，茎部包含6个碱基对。在E-MBP的环部分结合两个AP位点是APE1介导的信号放大的关键。对于活细胞中的RNA成像，E-MBP-靶双链体的熔化温度必须高于37℃。酶切AP位点后，双链体的熔化温度低于37°C，靶标与切割的信标分离，用于下一个循环。在选择靶mRNA结构域时需要考虑两个关键问题。首先，为了最大限度地减少与非靶mRNA的假结合，通过基本局部比对搜索工具（BLAST）分析选择IL-6 mRNA特有的序列。其次，由于mRNA通常形成复杂的二级结构，这可能限制MB与目标序列的结合，因此应选择不在这种二级结构内的合适的目标域。

图1 探针的设计

如图2a所示，在没有APE1激活的情况下，添加IL-6mRNA只观察到E-MBP的轻微荧光增加。相反，当存在靶mRNA时，APE1激活E-MBP时，荧光强度增加17倍，表明APE1介导的信号放大。在只存在APE1的情况下，E-MBP的荧光强度才保持在背景水平。E-MBP与APE1的激活引发了对靶mRNA的高反应速率，而当在不存在APE1时添加靶时，荧光强度略有增加（图2b）。E-MBP荧光强度的增加显示了APE1 mRNA的浓度依赖性（图2c）。APE1辅助测定的检测限计算为6.4pm，比常规MB方法低46倍。这是因为在常规方法中，一个靶RNA只能将一个MB转化为其荧光形式，而一个靶可以通过APE1介导的切割机制打开多个MB，导致灵敏度明显提高。

图2 体外APE1激活信号放大策略的评估

此外，该方法具有足够高的特异性以将靶RNA与其他RNA区分开（图2d）。为了证实信号放大是由于APE1介导的AP位点的切割，作者设计了与E-MBP具有相同序列但其环内没有AP位点的常规MB探针（表示为MBP）。在MBP中未观察到APE1辅助信号放大（图2e），证实了AP位点在该设计中的关键作用。作为另一对照，通过突变E-MBP序列设计了一种非活性MB探针（E-nMBP），以抑制其与IL-6mRNA的特异性结合。作者通过凝胶电泳分析进一步验证了扩增机制（图2f）。E-MBP与靶mRNA孵育后，出现一条高分子量的条带（泳道3），这意味着两条链的杂交。加入APE1后，该条带消失，观察到靶mRNA和E-MBP切割产物的条带（泳道5），证实了APE1对E-MBP的RNA依赖性切割。相反，当在存在APE1的情况下使用常规MBP时，靶mRNA不能从杂交状态释放（泳道7）。E-nMBP的分析表明突变探针对靶mRNA没有反应（泳道8）。选择聚乙二醇化聚（甲基丙烯酸氨基乙酯）基三嵌段共聚物作为E-MBP细胞内递送的非病毒载体（图2g）。聚合物可以通过静电相互作用以6的重量比完全结合E-MBP，从而形成尺寸约为190nm的均匀颗粒（E-MBP/V）（图2h，i）。

图3 炎症细胞中IL-6 mRNA的APE1易位介导成像

接下来，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）研究了E-MBP/V进入炎性细胞和从内体逃逸的能力。为了在体外构建炎症系统，用脂多糖（LPS）预处理Raw264.7巨噬细胞以建立炎症M1样巨噬细胞。巨噬细胞极化通过特异性表面标记物CD86的表达进行验证，通过标准免疫荧光染色和流式细胞术进行评估。在刺激后4小时观察到IL-6 mRNA的细胞内水平显著增加，这与引发和维持炎症有关。不同内吞抑制剂对E-MBP/V细胞摄取的影响的评估表明，探针通过内吞途径内化到细胞中。此外，三维荧光成像显示E-MBP的荧光信号与Lyso Tracker Green的荧光信号重叠很差，皮尔逊相关系数为0.43（图3a）。E-MBP/V的内体逃逸能力通过使用特异性内体标记物的时间依赖性共定位得到证实（补充图1a）。使用广泛使用的内体酸化抑制剂巴非霉素A1进一步确定内体逃走机制。结果表明，在存在抑制剂的情况下，E-MBP的内体逃逸被显著阻断（补充图1b，d），证实了质子海绵效应介导的内体逃脱机制3。此外，E-MBP/V对细胞存活率没有明显影响（补充图1c），表明它们具有良好的生物相容性。 

补充图1

在建立有效的细胞内化后，作者评估了E-MBP/V检测炎性细胞中靶RNA的能力。如图3b所示，将E-MBP/V应用于未经LPS处理的细胞导致最小细胞荧光信号。相反，在LPS预处理的细胞中观察到明显更高的荧光信号。流式细胞术定量显示，当细胞用LPS预处理，然后暴露于E-MBP/V时，细胞荧光信号与未经LPS预处理的暴露于E-MBP/V的细胞相比增加了6.2倍（图3c）。使用常规MB方法（负载MBP以产生MBP/V的颗粒）的对照实验在活化巨噬细胞中显示出比E-MBP/V低得多的荧光强度（图3b、c）。作为另一对照，E-nMBP/V（负载有非活性E-nMBP的颗粒）在炎症细胞中几乎没有荧光信号，证实E-MBP/V的细胞内荧光响应是由于靶mRNA的特异性识别。总之，这些结果确实证明E-MBP/V对炎症细胞中的扩增RNA成像具有显著的敏感性增强。

为了证实RNA成像确实来自转位的APE1对E-MBP的靶依赖性切割，作者通过免疫荧光染色测量了在有或没有LPS刺激的Raw264.7细胞中APE1的分布（图3d）。结果表明，在LPS处理前，APE1主要定位于细胞核，而在LPS刺激后，APE1在细胞核中减少，细胞质中增加。这些数据证实，一部分APE1从细胞核转移到E-MBP/V定位的细胞质，这是炎症细胞中E-MBP比正常细胞中特异性信号放大的关键。为了进一步证实APE1在信号放大中的作用，我们使用7-硝基吲哚-2-羧酸（NCA），一种APE1抑制剂，下调LPS刺激的Raw264.7细胞中的APE1活性。然后，用E-MBP/V对细胞内mRNA进行成像。如图3e所示，与未处理细胞相比，观察到NCA处理细胞中荧光信号明显降低。流式细胞术的定量分析表明，用NCA预处理的细胞的荧光强度比未处理的细胞低2.4倍（图3f）。这些结果证实了炎症细胞中APE1的活性对于细胞特异性信号放大至关重要。  

图4 小鼠脚趾LPS刺激炎症模型体内急性炎症成像

在体外得到良好的检测效果之后，作者将这套体系运用于小鼠内的成像。通过在右后爪皮下注射LPS建立小鼠急性脚趾炎症模型，左后爪注射PBS作为对照。在用E-MBP/V处理后的不同时间点收集小鼠的荧光图像。LPS处理的爪子显示出持续的荧光增强，在注射E-MBP/V后30分钟信号最大，而在PBS处理的爪子中没有观察到明显的荧光增强（图4b，c）。定量显示，在注射E-MBP/V后30分钟，用LPS预处理的爪显示出比用PBS预处理者高4.4倍的荧光强度（图4d）。当使用常规MBP/V进行类似测试时，在成像过程中，在LPS处理的爪中仅观察到轻微的荧光增强（图4b-d）。这清楚地表明，在E-MBP/V组中观察到的较强荧光信号是由于APE1介导的信号放大。为了直观地比较两种探针的灵敏度，我们在LPS刺激后分别向小鼠的右爪和左爪注射等量的E-MBP/V和MBP/V。与接受MBP/V的左爪相比，用E-MBP/V处理的右爪显示出高得多的荧光（图4e）。定量分析表明，在注射后30分钟，右爪显示出比左爪强约2.2倍的荧光强度（图4f）。

炎症诊断的挑战之一是早期检测。上述结果表明，E-MBP/V允许在LPS刺激90分钟时进行快速靶向成像，以评估急性炎症。该性能与通过常规定量聚合酶链反应和逆转录（qRT–PCR）技术测量的mRNA水平可辨别变化的时间点非常一致（图4g）。值得注意的是，在LPS刺激后90分钟，爪组织的苏木精和伊红（H&E）染色显示出不明显的组织学变化，而在LPS激励后3小时内观察到明显的炎性浸润（图4h）。这些结果表明，炎症相关RNA的上调先于组织学变化，这意味着E-MBP/V在炎症早期诊断中的潜力。  

补充图2

受到在小鼠体内的炎症组织中良好成像效果的鼓舞，作者将mRNA成像用于药物诱导肝毒性的早期诊断。药物诱导的肝毒性是一个重要的健康问题。由于缺乏直接检测早期生物标志物的方法，目前的肝毒性诊断受到限制。作者首先在体内研究了E-MBP/V的安全性，血清中的生化参数和主要器官的组织学分析表明E-MBP/V具有良好的生物相容性（补充图2）。此外，生物分布研究显示E-MBP/V在肝脏大量累积，表明E-MBP/V在体内检测药物诱导的肝毒性的可行性（补充图3）。

补充图3

众所周知，对乙酰氨基酚（APAP）是一种典型的抗疼痛/发热药物，过量会导致I期代谢引起的肝毒性。因此，选择APAP诱导的肝毒性作为评估E-MBP/V检测能力的理想模型（图5a）。以中毒剂量（300mg/kg）向小鼠腹腔内（i.p.）注射APAP−1） 随后在APAP治疗后15分钟尾静脉给药E-MBP/V。对照组在注射APAP前用PBS或N-乙酰-l-半胱氨酸（NAC）治疗，这是一种肝脏保护药物。通过APAP治疗后15分钟至75分钟的全身成像研究E-MBP/V的早期检测性能。如图5b所示，APAP预处理在成像的时间过程中在肝脏中呈现逐渐的信号增强，但在PBS预处理的对照组中观察到可忽略的荧光变化。同时，与APAP组相比，用NAC加APAP处理的小鼠在肝脏中显示出明显降低的信号。定量分析显示，在APAP治疗后75分钟，E-MBP/V在肝脏中显示的荧光信号分别比MBP/V和E-nMBP/V高约1.9倍和3.2倍（图5e-h）。在施用探针后1小时进行尸检时收集的肝脏的离体成像（图5i）。APAP处理组肝脏中的E-MBP/V信号比PBS处理组高3.8倍，比APAP预处理组中的MBP/V信号高1.8倍（图5j）。

图5 APAP诱导小鼠肝损伤模型早期诊断成像

为了将E-MBP/V的检测能力与临床方法进行比较，我们在使用APAP治疗后的不同时间点对肝组织进行了组织学分析。H&E染色显示，在注射APAP后180分钟内观察到不均匀的肝细胞形态和大量炎性细胞浸润（图6a）。通过血清生化测定进一步证实了这种时间依赖性肝毒性（图6b，c）。在APAP刺激后180分钟，观察到丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶水平的统计学显著升高。已知免疫反应通过上调肝毒性促炎因子（例如IL-6 mRNA）的水平来初始化肝损伤，这为体内早期炎症评估提供了有价值的靶点。接下来，我们通过传统的qRT-PCR研究了炎症过程中靶mRNA的水平。在施用APAP后约30分钟，观察到IL-6 mRNA显著增加，表达水平持续增加至90分钟（图6d）。此外，随着NAC的进一步处理，靶mRNA显示出统计学显著降低（图6e）。值得注意的是，IL-6 mRNA在不同时间点的动态变化与药物刺激后E-MBP/V的成像结果良好相关，证实该方法可精确区分药物诱导肝损伤中的炎症。图6f总结了通过基于E-MBP/V的成像和血浆/组织学方法的药物诱导肝毒性的最早检测时间点。在APAP孵育后45分钟，E-MBP/V显示出第一个具有统计学意义的信号变化，这比H&E染色和生化测定早至少135分钟。

图6 与临床测定的比较

小结

基于DNA的技术，如FISH，MB和荧光团结合RNA适配子已被积极用于RNA成像。这些系统通常建立于一对一的信号读出，导致灵敏度不足，无法准确成像低表达水平的RNA。作者团队展示了一种简单而强大的策略，用于疾病部位特异性进行信号放大。E-MBP是通过将酶促活化的AP位点掺入MB结构而设计的。APE1激活的信号扩增能够以高灵敏度和空间选择性对炎症相关RNA进行成像。E-MBP需要对双重标志物进行相关处理，以产生用于检测炎症的放大信号，其诊断比临床诊断方法早得多。E-MBP代表了一种信号扩增策略，不仅允许在体内进行空间控制的RNA成像，而且还有助于实时监测和诊断药物诱导的毒性。
    可以预见的是这种方法的应用将扩展到不同领域。尽管在检测RNA的方法发展方面取得了巨大进展，但活体动物中炎症相关RNA成像的灵敏和特异性问题仍待克服。APE1介导的信号扩增对炎症部位具有高空间选择性，与传统的MB技术相比，显着提高了灵敏度，并且具有检测任何目标序列的多功能性，为阐明RNA在炎症进展和治疗中的生物学功能提供了独特的工具。此外，APE1的表达和亚细胞定位的动态改变也在其他疾病中观察到，包括癌症、心血管疾病和神经退行性疾病。因此，选择合适的RNA生物标志物，该方法也可能扩展到此类疾病的诊断。