NAT NANOTECHNOL丨基于核苷酸纳米复合物修饰的超声微泡的图像引导 STING 激活的癌症免疫治疗
大家好，今天分享的文献是2022年8月发表在Nature Nanotechnology上的一篇文章《Cancer immunotherapy based on image-guided STING activation by nucleotide nanocomplex-decorated ultrasound microbubbles》，通讯作者是来自于德克萨斯大学MD安德森癌症中心肿瘤放疗系的Wen Jiang和来自于德克萨斯大学西南医学中心放射学系的Jacques Lux。Wen Jiang教授主要研究实体肿瘤中的免疫抑制机制，并开拓克服免疫逃逸的治疗新策略，Jacques Lux教授则聚焦于研发可被激活的超声成像造影介质，以及基于超声的多种诊疗手段。
研究背景
目前，癌症的免疫疗法在一些难治性转移性癌症上展现出不错的临床效益，譬如黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌。尽管大多数癌症免疫疗法的重点是增强自身的特异性免疫，但学界也越来越意识到，要产生更好的抗肿瘤免疫效果，则可能需要免疫系统中的特异性和非特异性免疫都参与其中。这一共识推动了靶向非特异性免疫系统调控因子的新策略研发，这之中的目标便包括胞质DNA感受器环鸟苷酸腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子信号通路(cGAS-STING signaling)。其中，激活STING可以刺激I型干扰素(IFN)反应，对于启动肿瘤特异性细胞毒性T细胞至关重要。然而，STING是一种胞质蛋白，其天然激动剂如环状GMP-AMP (cGAMP)的胞质递送效率较差，且血清稳定性低，组织清除率快；此外，STING的非特异性激活可能会导致广泛的炎症反应，并阻碍其临床转化。因此，利用cGAMP靶向并有效激活STING的新策略研发将很大程度上促进其临床转化。本文的作者基于该点，推动研发了一种MUSIC（Microbubble-assisted ultrasound-guided immunotherapy of cancer）疗法，旨在使用微泡辅助cGAMP递送，超声引导癌症治疗，最终提升癌症免疫疗法的效果。
研究结果
图1 合成并表征靶向CD11b的ncMBs
首先研究者们对他们所设计的MUSIC平台进行制备与表征。他们计划使用含有cGAMP分子的纳米复合物偶联微泡(ncMBs)靶向抗原递呈细胞(APCs)，通过超声(US)引导，使得具有靶向性的微泡产生振荡，并在细胞膜上产生瞬时声孔，从而使负载的cGAMP能够直接进入细胞质中，并激活STING（图1A&B）。为了最大限度地增加cGAMP的载量，研究者们合成了精胺修饰的葡聚糖(SpeDex)，并将其巯基化，偶联至含马来酰亚胺的微泡表面（图1C）。为了使微泡能够靶向抗原递呈细胞（如巨噬细胞和树突状细胞），研究者们将抗CD11b抗体(aCD11b)或同型IgG(不具有靶向性的抗体对照)巯基化并同样偶联在微泡的马来酰亚胺基团表面。研究者们发现有超过99%的微泡在其表面同时与SpeDex和aCD11b偶联，这些双重偶联的微泡 (cMBs)平均大小为2.6 μm，每cMB中含有约30万抗体（图1D）。研究者们接着将货物，也就是cGAMP添加至已经偶联有SpeDex的cMBs上，这种方法可使得98%以上的cMBs携带cGAMP，且每个ncMB上平均负载有1.25 × 108个cGAMP分子（图1E&F）。接着，为了验证ncMB的靶向特异性，研究者们用DiD（一种染料）标记ncMBs，并将其与THP-1人巨噬细胞(CD11b+)和EO771乳腺癌细胞(CD11b-)一同孵育。荧光显微镜图像显示ncMBs与THP-1巨噬细胞孵育后有大量的细胞-ncMB复合物出现，而与EO771细胞孵育后则没有（图1G)。为了证明ncMBs能有效地将环二核苷酸(CDNs)递送至APCs的胞浆内，研究者们将荧光标记CDN (DY547-c-diGMP)组装至ncMBs上，与小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）共同孵育，并使用平面波换能器在1 MHz的条件下对细胞进行MUSIC超声处理，从而使得胞膜上产生瞬时孔道。BMDMs的平均荧光强度显示，MUSIC处理使CDNs的摄取相对于游离CDN增加了约4倍（图1H&I)。同时，为了评估声孔的产生是否具有细胞毒性，研究者们在1 W/cm2的MUSIC超声处理后48 h测量了EO771和THP-1细胞的活力，结果显示EO771细胞的活力几乎没有损失，THP-1细胞的活力下降了约25%。以上这些结果共同表明ncMBs具有较好的的偶联效果、cGAMP载量，也有着较为理想的靶向特异性、核酸递送效率和可接受的毒性。
图2 ncMBs靶向APCs可在体外诱导STING-IRF信号通路的激活
接着，研究者们对于MUSIC疗法能否成功激活下游信号进行了探索。cGAMP作为一种内源性第二信使，能够激活STING及其下游的IFN通路。上一部分中研究者们已证明MUSIC疗法能增强CDNs递送至巨噬细胞胞质内的效率，他们便推测MUSIC也会增强APCs中的STING激活。验证结果显示，采用MUSIC疗法治疗6小时后，小鼠BMDMs和人THP-1细胞中出现了STING和下游干扰素调节因子3（IRF3）的显著磷酸化（图2A)。为了证实IRF3的激活是由STING介导的，研究者们用MUSIC疗法处理了STING-/-小鼠的BMDM细胞，并没有观察到任何I型IFN炎症反应，这也证实了MUSIC产生的免疫反应和下游物质的激活是STING依赖性的（图2B)。接着，为了证明STING的激活能够成功导致下游的信号级联反应和转录活动，研究者们检测了作为促炎基因转录因子的磷酸化IRF3(pIRF3)是否进行了核转运，能够观察到活化的pIRF3有着显著的核内分布（图2C)。同时，能够观察到STING途径的另一个主要下游成分NF-κB在MUSIC处理下也被激活，具体表现为IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化增加，而在STING-/-小鼠的BMDMs并没有观察到以上现象（图2D&E)。MUSIC治疗后，同样能观察到BMDMs和THP-1细胞中p65核转运增加，进一步提示NF-κB信号通路的激活（图2F)。不仅如此，与单独用cGAMP处理的细胞相比，在MUSIC处理的BMDMs和THP-1细胞中IFN基因与蛋白表达都更高；相反，STING-/-小鼠体内的APCs中没有观察到IFN mRNA和蛋白质的表达升高，这些结果都提示MUSIC疗法依赖STING信号通路，从而发挥作用（图2G&H)。
巨噬细胞作为APCs，可以启动T细胞，而这一过程可以通过激活STING来放大，从而促进T细胞增殖,并发挥有效的抗肿瘤免疫效益。为了评估MUSIC能否加强APCs产生具有抗肿瘤效应的适应性免疫应答，研究者们评估了MUSIC处理后CD8+和CD4+T细胞的增殖情况。与MUSIC处理的BMDMs共培养时，CD8+、CD4+ T细胞增殖均较其它组增加，而这种增强的T细胞启动效应在STING-/- BMDMs中并不存在，提示这是一种STING依赖性的反应（图2I&J)。
图3 MUSIC疗法可在体内激活STING信号和T细胞应答
为了评估在体外观察到的STING激活是否在体内也有效，研究者们在小鼠乳腺癌模型中评估了MUSIC的抗肿瘤效果。首先，研究者们通过超声画面将MUSIC疗法在体内的效果可视化，信号的减弱提示超声处理后微泡结构遭到破坏(图3A)。同时，肿瘤切片的免疫组化染色证实MUSIC能够抑制Ki67的表达，但对其它组织没有直接影响，提示肿瘤增殖得到抑制。研究者们还对肿瘤免疫微环境进行评估，结果显示，在经MUSIC处理的肿瘤组织中，STING的磷酸化水平增加，尤其是在CD11b+的细胞中(图3B&C)，且STING磷酸化的增加与MUSIC治疗后CD8+/CD4+ T细胞被招募到肿瘤中的增加相关(图3D)。以上结果共同表明MUSIC疗法可在体内（小鼠原发乳腺癌模型）激活STING信号通路与T细胞应答。
图4 MUSIC激活STING介导的抗肿瘤免疫
为了评估MUSIC介导的STING激活对肿瘤生长的影响，研究者们使用MUSIC、cGAMP、cMBs (+US)或不具有靶向性的IgG-ncMBs (+US)治疗小鼠，并随时间进行监测。他们观察到，在三种治疗中，每隔一天给予MUSIC疗法展现出了最显著的肿瘤抑制效果和生存时间的延长(图4A-D)。通过将MUSIC疗法和IgG-ncMBs (+US) / ncMBs组比较，作者们证实了超声与靶向CD11b都是疗法有效的必要条件，但凡缺失其中任意一个因素抗肿瘤作用都将降低(图4C)。同时，在经MUSIC处理的STING- / -肿瘤小鼠中未观察到抗肿瘤作用(图4E&F)。此外，10只经MUSIC处理的小鼠中有6只的肿瘤得到完全根除，且对这些小鼠再次进行EO771肿瘤细胞接种时表现出抗性，表明MUSIC处理在小鼠体内产生了抗肿瘤的记忆效应(图4G)。为了进一步验证MUSIC疗法介导的抗肿瘤记忆效应，作者们通过流式细胞术分析了MUSIC处理过的肿瘤组织样本，并检测到经过MUSIC处理后，CD44highCD62Llow效应记忆T细胞和CD44highCD62Lhigh中央记忆T细胞数量有所增加。此外，作者们从MUSIC处理的肿瘤小鼠脾脏中收集得到T细胞，并在体外用EO771肿瘤细胞重新刺激它们时，能够观察到显著的IFN-γ反应，证实了局部MUSIC处理在体内产生了系统性的免疫记忆(图4H&I)。
考虑到APCs中STING的激活可导致I型IFN的产生，并且CD8+ T细胞分泌IFN-γ从而产生抗肿瘤作用，作者们接下来测量了I型IFN和IFN-γ水平，发现MUSIC疗法处理后这些细胞因子在小鼠肿瘤和血清中升高。由于已知IFN-γ可诱导免疫检查点的表达，如PD-L1，作者又分别测定了T细胞和肿瘤细胞中PD-1和PD-L1的表达。结果显示在MUSIC处理组中，超过95%的肿瘤内CD8+ T细胞有着PD-1表达的升高，且肿瘤组织PD-L1的表达也与IFN-γ水平呈正相关(图4J&K)。这些结果表明MUSIC疗法通过APCs触发STING介导的T细胞活化，从而同时激活先天性和适应性免疫反应，并提示MUSIC与免疫检查点阻断联合使用可能能够产生更好的抗肿瘤效应。
图5 MUSIC激活全身抗肿瘤免疫反应从而抑制乳腺癌转移
为了验证MUSIC疗法能否改善全身的抗肿瘤反应，研究者们接着评估MUSIC是否能增强免疫原性较差的肿瘤对PD-1阻断的敏感性，特别是那些高度侵袭、广泛转移的肿瘤。研究者们使用MUSIC + 抗PD-1抗体 (aPD-1)联合治疗具有自发转移特性的小鼠三阴性4T1乳腺肿瘤。结果显示，局部MUSIC处理结合全身aPD-1治疗不仅增强了原发性肿瘤的控制，而且还大大降低了肿瘤在全身的进展(图5A&B)。与单独使用cGAMP或aPD-1相比，联合治疗组的中位生存期增加了76%(图5C)。宏观器官成像结果显示肺转移结节减少约60%(图5D-F)。为了评估联合治疗对局部和全身免疫的影响，研究者们测量了肿瘤和血清中的I型IFN水平，发现联合治疗组的IFN水平明显高于对照组(图5G)。同时，联合治疗组CD8+和CD4+ T细胞的浸润也有所增加(图5H-K)，伴有STING磷酸化增强与IFN-γ生成增多(图5L-O)。最后，为了探索联合治疗对记忆T细胞反应的影响，研究者们收集了不同治疗组的肿瘤浸润淋巴细胞，发现联合治疗增加了CD44highCD62Llow效应记忆细胞和CD44highCD62Lhigh中央记忆细胞的比例(图5P&Q)。总之，这些结果表明MUSIC疗法可以使得免疫原性较差的肿瘤对PD-1阻断敏感，且联合疗法增强了局部和全身免疫反应，最终产生更好的抗肿瘤效果。
研究结论
综上所述，本文的研究团队开发了一种超声引导的癌症免疫治疗平台MUSIC，使用含有大量cGAMP分子的纳米复合物与APC靶向微泡偶联；修饰后的微泡与APC结合，并在超声引导下通过瞬时声孔作用有效地将cGAMP递送到细胞质中，从而激活cGAS-STING和下游通路，并有效地激活抗原特异性T细胞。他们所开发的MUSIC疗法成功桥接了先天性免疫和适应性免疫，显著抑制了局部和转移性小鼠癌症模型中的肿瘤生长。同时，MUSIC成功提升了货物核酸的稳定性、装载效率与靶向递送效果，并最大限度地降低了全身毒性。未来，具有多功能性的MUSIC平台还有望应用于其它免疫治疗药物的靶向输送，譬如核酸疫苗及更多疾病的基因疗法。
