ANGEW | 利用生物正交反应检测活细胞中蛋白特异性糖化
蛋白质糖化修饰是碳水化合物在蛋白质N端α-氨基或蛋白质赖氨酸和精氨酸侧链上的非酶翻译后修饰。蛋白质糖化修饰不同于蛋白质糖基化，蛋白糖基化修饰需要糖基转移酶的作用。糖化修饰损害重要蛋白的功能和结构，常与各种衰老相关疾病（比如肿瘤，糖尿病，神经退行性疾病）的发展有关。因此监测蛋白特异性糖化对于进一步揭示这些疾病的分子机制和潜在的治疗方法具有重要意义。然而，由于缺乏合适的化学和生物工具，以及蛋白质糖化的内在异质性，对活细胞中蛋白质特异性糖化的鉴定、表征和探索具有高度的挑战性。由于缺乏修饰特异性抗体以及抗体与天然蛋白的高交叉反应性，抗体的使用场景非常有限。
近日，中国科学院基础医学与肿瘤研究所李娟课题组开发了一种基于糖化化学报告基因和邻近诱导荧光共振能量转移(FRET)信号读出的活细胞中蛋白特异性糖化的视觉分析策略。相关工作发表在Angew. Chem. Int. Ed.上，题为: Visualization of Protein-Specific Glycation in Living Cells via Bioorthogonal Chemical Reporter。
该策略分别依赖于一种糖化化学报告物和两种DNA探针，即糖化转换探针(GCP)和蛋白质靶向探针(PTP)。开发了一种生物正交糖化化学报告分子6AzGlc作为葡萄糖(Glc)类似物，它可以探测细胞表面的糖化蛋白。随后，DBCO和Cy3修饰的GCP（绿色）通过生物正交反应连接到糖化蛋白上。糖化的信息可以转化为特定的DNA序列。最后，将PTP设计为分子信标结构，包括蛋白质识别域（蓝色）、loop区（绿色）和Cy5。该loop区与GCP序列互补，可以促进PTP的构象变化，打开信标结构。PTP对目标蛋白的识别诱导了GCP和PTP之间的接近杂交，触发了FRET信号读出。因此，该策略将为分析活细胞中蛋白质特异性糖化及其相应的功能特性提供一个合适的工具。
Glc由于其在人体中的高丰度，是一种重要的蛋白质糖化剂。血红蛋白和血浆白蛋白的葡萄糖糖化已被用作监测和筛查糖尿病。然而，目前对葡萄糖糖化对特定膜蛋白的作用影响知之甚少。使用6AzGlc，其保留了C-1的糖化活性，并携带了一个生物正交标记作为糖化化学报告物。另外，C-6处的叠氮修饰可以阻止6-羟基的磷酸化产生葡萄糖-6磷酸，这是碳水化合物代谢的中心枢纽，从而减少葡萄糖代谢物的产生，从而降低对糖化探测的干扰。一旦蛋白质被6AzGlc成功糖化，叠氮化物允许随后的信号转换和蛋白质富集。同时，使用1AzGlc作为对照，保留了生物正交反应标签，但不能引起糖化。
为了评估三种报告物的糖化活性，首先将每个报告物与游离赖氨酸在37℃下孵育24小时，然后用质谱法对产物进行分析。6AzGlc和Glc分别生成了预测的Glc-Lys和6AzGlc-Lys早期糖化加合物。然而，在1AzGlc组中未检测到早期糖化加合物。接下来，评估了糖化报告物对人血清白蛋白(HSA)的反应性。将HSA与每个报告基因在37°C下孵育24h后分析果糖胺（fructosamine，一种早期的糖化产物）。Glc和6AzGlc处理组产生的果糖胺均以剂量依赖性的方式增加。然而即使在高浓度的1AzGlc(100mM)孵育后，果糖胺水平也几乎没有增加，表明没有糖化。6AzGlc与Glc相比具有较高的糖化活性。
- Glc和6AzGlc处理组产生的果糖胺均以剂量依赖性的方式增加
- Glc和6AzGlc处理导致血红蛋白糖化
在体外验证了6AzGlc可以与蛋白发生反应后，研究了其对活细胞的糖化反应性。将红细胞与报告物孵育，发现了与HSA糖化相似的结果。6AzGlc处理组的糖化血红蛋白(HbA1c)产量高于Glc处理组，而1AzGlc处理组的HbA1c含量几乎没有增加。接下来，尝试使用6AzGlc来探测活细胞中的膜蛋白糖化。细胞与6AzGlc孵育后，使用DBCO偶联的Cy5染料(DBCO-Cy5)通过点击反应进行后续信号读出。
优化6AzGlc浓度和孵育时间后，50 mM 6AzGlc孵育24 h的细胞显示出满意的标记和细胞活力。在相同的条件下，1AzGlc处理的细胞显示的荧光信号可以忽略不计，从而消除了染料或偶氮化报告物的非特异性吸附的干扰。
（左）50 mM 6AzGlc孵育24 h的细胞显示出满意的标记和细胞活力
（右）1AzGlc处理的细胞显示的荧光信号可以忽略不计
为了研究基于6AzGlc的标记途径，分别使用了糖化抑制剂氨基胍(AG)，N-糖基化抑制剂tunicamycin(TM)，O-糖基化抑制剂NTG和O-GlcNAc糖基化抑制剂OSMI-1与6AzGlc孵育细胞。三种抑制剂(TM、NTG、OSMI-1)覆盖了大部分的糖基化途径，对膜荧光强度的影响可以忽略不计。相反，AG可以显著地降低膜荧光，表明6AzGlc诱导的标记可能主要来自糖化（glycation），而不是糖基化（glycosylation）。此外，在对提取的细胞蛋白进行凝胶内成像荧光扫描时，也有类似的现象。
6AzGlc的标记途径基于糖化，而不是糖基化
有报道称，在高血糖环境下，畸形红细胞的比例可显著增加，而这种形态学变化与细胞膜成分的糖化水平有关。利用6AzGlc直接可视化的糖化位点，本研究试图通过6AzGlc促进的糖化成像来评估膜蛋白糖化与红细胞畸变之间的相关性。随着报告物浓度的增加，红细胞膜上的荧光信号逐渐增加，表明糖化水平逐渐升高(A图)。Glc和1AzGlc基团分别由于缺乏叠氮化处理或糖化活性而不能产生荧光信号(B和C图)。因此，认为6AzGlc可以用于红细胞膜糖化水平的成像和分析糖化引起的生物学功能。
6AzGlc、Glc和1AzGlc在活细胞中进行糖化标记以及畸形红细胞的比例
在验证6AzGlc在活细胞中进行糖化标记的可行性后，研究者探索了细胞膜上的蛋白特异性糖化。作为一种概念证明，程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的糖化在免疫逃逸中发挥了重要作用。本文以PDL1适配体作为识别模块构建PTP，并设计了相应的GCP。为了尽量减少分子信标对适配体结合的潜在干扰，我们进行了多轮信标序列优化，最终得到了与原始适配体具有相似亲和力的PTP。在GCP的优化方面，初始GCP与糖化蛋白之间的反应效率很低。糖化氨基酸暴露不足可能会阻碍DBCO与叠氮化的接触。因此，试图用聚乙二醇(PEG)来修饰GCP，以增加终端DBCO的灵活性。结果表明，这种修饰可以大大提高点击反应的效率。
接下来观察了细胞中PD-L1的糖化情况。用6AzGlc糖化的细胞依次用GCP和PTP-PD-L1处理。得益于适配体的靶向性，我们成功地检测到了MDA-MB-231细胞表面的邻近诱导的FRET信号。为了验证Cy5信号确实来自FRET，先对受体Cy5进行了光漂白，然后FRET诱导的Cy5信号消失，而供体Cy3发射增强，这证实了FRET过程。此外，AG对糖化的抑制明显削弱了FRET信号的强度，进一步证明了该策略的特异性。
为了验证这一策略的通用性，设计并优化了另外两种膜蛋白的PTP，即间充质上皮转化(c-Met)受体和酪氨酸蛋白激酶7(PTK7)。在Hela细胞(c-Met高表达)和CEM细胞(PTK7高表达)表面观察到高FRET信号，验证了这两个靶蛋白上存在糖化。
为了进一步证明蛋白质糖化成像策略的特异性，利用全内反射荧光(TIRF)成像在单分子水平研究特异性蛋白质的糖化。PD-L1和c-Met常在各种肿瘤中过表达，并且可以直接相互作用，因此使用PD-L1作为c-Met邻近蛋白的模型。首先，构建了一个稳定表达PD-L1的HeLa细胞系，PD-L1与增强的绿色荧光蛋白(EGFP)标签相融合。然后，加入设计的PTP-PD-L1和PTP-c-Met探针，分别检测PD-L1和c-Met糖化。无论是用PTP-PD-L1还是PTP-c-Met处理，我们都检测到明显的FRET信号，表明PD-L1和c-Met都是糖化的。然而，只有PTP-PD-L1的FRET信号与EGFP信号(代表PD-L1信号)具有较高的Pearson相关系数（0.74），表明PD-L1糖化信号与PD-L1蛋白之间存在较强的正相关关系。相比之下，PTP-c-Met的FRET信号与EGFP信号的Pearson相关系数很低（0.02），说明c-Met糖化信号与PD-L1蛋白的相关性较差。因此，FRET信号被证明是由感兴趣的糖化蛋白而不是其他邻近蛋白产生的。
活细胞TIRF成像
为了进一步验证PD-L1的糖化作用，3个报告物处理细胞后提取蛋白（输入组），用DBCO-PEG4-Biotin点击糖化蛋白，然后用链霉亲和素珠富集，去除未结合的蛋白后，珠子上的蛋白被洗脱，作为WB分析的输出组。虽然在3个报告物的输入样本中检测到PD-L1信号，但输出样本中只有6AzGlc处理的细胞具有较强的PD-L1信号，表明样本中存在糖化的PD-L1。这与上述实验的结论相一致。有趣的是，Glc和6AzGlc处理组的PD-L1条带明显弱于对照组(输入行)。
为了确定这是否是由于抗体对糖化PDL1的亲和力下降，评估了抗体的结合情况。结果显示，糖化处理后的印迹强度没有显著差异，这说明PDL1的糖化并不影响抗体的识别(上图B)。因此，怀疑糖化可能会影响蛋白质的含量。上图C显示，糖化水平的升高可显著降低PDL1的含量，特别是在糖化处理48h的组中。细胞膜PD-L1的荧光成像结果与上述结论一致(上图D)。除了对蛋白质含量的影响外，还探讨了糖化是否会影响PD-L1和PD-1之间的结合，这是影响癌细胞免疫应答的关键相互作用。上图E显示PD1与糖化PD-L1的结合明显减少。同样，PD-L1与PD-1在细胞表面的结合也随着糖化程度的增加而减弱（上图F）。因此，研究者认为糖化会降低PD-L1的含量，降低其对PD-1的亲和力，这可能是一个新的免疫治疗靶点。
为了扩大该策略的应用，还设计了根据RGD（一种特异性与整合素结合的肽）设计PTP-整合素探针。发现糖化可以调节整合素与RGD之间的亲和力。糖化处理的细胞更有可能粘附在纤维连接蛋白包裹的底物上，这种增强可被AG抑制，证明了黏附增强是由糖化引起的。这些结果表明，蛋白质特异性糖化成像可以加深对糖化对蛋白质功能影响的理解。
总之，该研究设计了一种生物正交的糖化化学报告物，利用FRET策略，用于活细胞中蛋白质特异性糖化的成像。本文所提出的化学报告物6AzGlc具有比天然葡萄糖具有更高的糖化反应活性，并成功地用于几种特定细胞膜蛋白的葡萄糖糖化可视化。该策略具有通用性，可以通过简单地改变识别模块，很容易地扩展到其他感兴趣的蛋白质。
